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摘要：普遍認(rèn)為低分子量 (LMW) 或高分子量 (HMW) 物質(zhì)等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)是治療性單克隆抗體 (mAb) 產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQAs)，需要在整個(gè)藥物生產(chǎn)過程中進(jìn)行監(jiān)測。本應(yīng)用簡報(bào)基于 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)結(jié)合帶 PEEK 內(nèi)襯的 AgilentPLRP-S 色譜柱的性能，開發(fā)了一種 RPLC 方法。通過分析 NISTmAb 的還原重鏈和輕鏈，即使梯度斜率非常平緩的情況下，也可觀察到出色的相對保留時(shí)間和面積偏差。方法開發(fā)后，兩條重鏈 (H2) 或兩條重鏈一條輕鏈 (H2L) 等所有相關(guān) LMW片段均可得到分離與檢測。得益于與 UV 和 MS 檢測器的依次聯(lián)用，該方法可用于生物藥物生產(chǎn)鏈的多個(gè)領(lǐng)域。該方法也可作為 SDS-PAGE/CE-SDS 的替代方法，在一次運(yùn)行中分析兩種 CQAs ― LMW 物質(zhì)以及翻譯后修飾 (PTMs)。

前言 ：mAbs 是生物藥物中一類主要的產(chǎn)品，已成功用于各類疾病的治療[1]。這些生物分子具有保守的異四聚體結(jié)構(gòu)，由兩條重鏈和兩條輕鏈通過二硫鍵連接組成。在生產(chǎn)過程中或儲存不當(dāng)時(shí)，可能會形成某些產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，如 LMW 物質(zhì)（見圖 1）或HMW 物質(zhì)（如抗體二聚體）。即使經(jīng)過大量純化步驟，這些雜質(zhì)也可能也仍會存在，因此有必要將它們作為藥品的 CQA進(jìn)行監(jiān)測。抗體二聚體、三聚體或多聚體等 HMW 物質(zhì)可通過體積排阻色譜 (SEC)和 UV 檢測進(jìn)行常規(guī)分析和分離[2]。SEC與 MS 檢測聯(lián)用，可用于進(jìn)一步表征雜質(zhì)的相關(guān)分子量和 PTMs[3]。重鏈 (H)、輕鏈 (L) 或 H2L 片段等 LMW 物質(zhì)可通過毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉 (CE-SDS) 進(jìn)行分析[4]。遺憾的是，由于 SDS 引起的高離子抑制，CE-SDS 無法與 MS 檢測聯(lián)用，因此 LMW 物質(zhì)的推測鑒定通常根據(jù)經(jīng)驗(yàn)知識進(jìn)行。本應(yīng)用簡報(bào)基于 1290 InfinityII 生物液相色譜系統(tǒng)和帶 PEEK 內(nèi)襯的 PLRP-S 色譜柱的性能，展示了mAbs 的 LMW 物質(zhì)的另一種分析方法。由于采用了反相液相色譜 (RPLC) 模式，NISTmAb 的所有相關(guān)還原誘導(dǎo) LMW 片段均可通過 UV 和 MS 進(jìn)行檢測，以根據(jù)需要用于常規(guī)或深入分析。

實(shí)驗(yàn)部分設(shè)備與 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF聯(lián)用的 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)包括以下模塊：– Agilent 1290 Infinity II 生物高速泵(G7132A)– Agilent 1290 Infinity II 生物 Multisampler(G7137A)，配備樣品恒溫箱（選件#101）– Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱(G7116B)，配備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)流速 QuickConnect 快速連接生物熱交換器(G7116-60071) 和兩個(gè)安捷倫熱平衡裝置 (G7116-60013)– Agilent 1290 Infinity II 可變波長檢測器(VWD) (G7114B)，配備生物微量流通池（用于 VWD，3 mm，2 µL，RFID）– Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF(G6545XT)

軟件– Agilent MassHunter 工作站數(shù)據(jù)采集軟件（B.09.00 或更高版本）– Agilent MassHunter 定性分析軟件（10.0 或更高版本）– Agilent MassHunter BioConfirm（10.0 或更高版本）色譜柱Agilent PLRP-S 5 µm 1000 ?,2.1 × 100 mm，帶 PEEK 內(nèi)襯（部件號 PL1912-2502PK）化學(xué)品使用 Agilent InfinityLab 超純 LC/MS 乙腈（部件號 5191-4496）和 AgilentNISTmAb（部件號5191-5744）。新制超純水來自配置 0.22 µm 膜式終端過濾器(Millipak) 的 Milli-Q Integral 水純化系統(tǒng)(Millipak, Merck-Millipore, Billerica, MA,USA)。DL-二硫蘇糖醇 (DTT) 購自 Merck(Darmstadt, Germany)。

樣品前處理將 40 µg NISTmAb 與 1 mmol/L DTT 在棕色玻璃樣品瓶中孵育，4 °C 下直接置于 1290 Infinity II 生物 Multisampler 中，可實(shí)現(xiàn) NISTmAb 的部分還原。將 40 µgNISTmAb 與 10 mmol/L DTT 在 60 °C 下孵育 30 分鐘，可實(shí)現(xiàn)重鏈 (H) 和輕鏈(L) 的*還原。進(jìn)樣濃度為 1 mg/mLNISTmAb 或還原 NISTmAb?！?/p>

結(jié)果與討論：從制造到質(zhì)量控制的整個(gè)生產(chǎn)過程中，對生物藥物的分析都需要液相色譜系統(tǒng)盡可能提供性能。為評估 1290 Infinity II生物液相色譜系統(tǒng)在 mAb 片段分析方面的性能，利用 DTT 將 NISTmAb *還原成 H 和 L 片段。圖 2 展示了七次連續(xù)進(jìn)樣獲得的相對保留時(shí)間和峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。結(jié)果表明，1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)與 6545XT AdvanceBioLC/Q-TOF 聯(lián)用的保留時(shí)間和峰面積，非常適合以平緩梯度分析 mAb抗體片段。盡管液相色譜方法由兩個(gè)線性梯度步驟組成（斜率分別為 0.32% 和0.55% B/min），但保留時(shí)間和峰面積精度的 RSD 值仍較低，前者為 0.190% (L)和 0.056% (H)，后者為 0.530% (L) 和0.744% (H)。采用 RPLC 分析 LMW 物質(zhì)時(shí)的一大挑戰(zhàn)是由于它們的疏水性與實(shí)際 mAb 相似，因此對 H2 或 H2L 等抗體片段的分離能力有所欠缺。這些片段可以在發(fā)酵過程中產(chǎn)生，也可以由最終產(chǎn)品發(fā)生部分還原得到。而這些片段也可通過少量 DTT 或降溫的方式經(jīng)過一定時(shí)間的部分還原而人工生成。利用這項(xiàng)技術(shù)，開發(fā)了一種基于帶PEEK 內(nèi)襯的 PLRP-S 色譜柱和 1290 InfinityII 生物液相色譜系統(tǒng)的 RPLC 方法。

圖 3 的色譜圖顯示了 NISTmAb 在 1290Infinity II 生物 Multisampler 中的動態(tài)還原情況。由于添加了 DTT，圖 1 所示的所有相關(guān) mAb 片段均實(shí)現(xiàn)很好的分離和隨時(shí)間的變化。尤其是 H2、H2L 片段和 NISTmAb 在 RPLC 中實(shí)現(xiàn)了非常出色的分離，因此帶 PEEK 內(nèi)襯的 PLRP-S 色譜柱和 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)的結(jié)合是分析 LMW 的方法。得益于 RPLC 模式，1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)可輕松與 6545XT AdvanceBioLC/Q-TOF 聯(lián)用，MS 數(shù)據(jù)可在 AgilentMassHunter BioConfirm 軟件中進(jìn)行分析。解卷積后，各片段的主要糖型如

圖 3 所示。NISTmAb 的特征性糖基化表明，該方法可輕松分析不同片段的PTMs。此外，圖 4B 所示為 mAb 峰周圍聚集片段的代表性離子的提取離子色譜圖(EIC)。得益于帶 PEEK 內(nèi)襯的 PLRP-S 色譜柱的優(yōu)秀分離能力，這些 EICs 也具有良好的峰形。由于儀器設(shè)置依次包括 1290 Infinity II可變波長檢測器和 6545XT AdvanceBioLC/Q-TOF，因此可在一次運(yùn)行中同時(shí)進(jìn)行 UV 和 MS 檢測，幾乎無譜帶展寬，并可輕松完成過程開發(fā)到質(zhì)量控制的方法轉(zhuǎn)移（圖 4A）。

結(jié)論傳統(tǒng) SDS-PAGE 和現(xiàn)代等效的 CE-SDS 均廣泛應(yīng)用于 LMW 和 HMW 物質(zhì)等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的分析。然而，利用這些方法鑒定 LMW 物質(zhì)結(jié)構(gòu)一直面臨著挑戰(zhàn)，且主要基于經(jīng)驗(yàn)知識。本應(yīng)用簡報(bào)介紹了一種RPLC 方法，該方法能夠分離 NISTmAb所有相關(guān)還原誘導(dǎo) LMW 物質(zhì)。基于重鏈和輕鏈片段分析結(jié)果，1290 Infinity II生物液相色譜系統(tǒng)展現(xiàn)出優(yōu)秀的保留時(shí)間和峰面積精度值。在 1290 Infinity  II生物 Multisampler 中對 NISTmAb 進(jìn)行動態(tài)還原，隨后用 6545XT AdvanceBio010203040506070809010016 19 22 25放大的 EIC 響應(yīng) (%)保留時(shí)間 (min)HLHNISTmAbH2LH2B00.51.01.52.000.050.100.150.200.250.3015 19 23 27保留時(shí)間 (min)A × 108 TIC 響應(yīng) (–) 響應(yīng) (mAU)圖 4. 一次運(yùn)行中獲得的 NISTmAb 周圍聚集片段的 MS 和 UV 譜圖 (A)。NISTmAb 片段的提取離子色譜圖，展現(xiàn)出出色的峰形 (B)LC/Q-TOF 進(jìn)行檢測，這一系列操作展現(xiàn)了該方法分析翻譯后修飾的潛力。與片段分析相結(jié)合時(shí)，這種能力可加速生物藥物的發(fā)展。這就是在生產(chǎn)工藝到最終質(zhì)量控制的生物藥物分析過程中，帶 PEEK 內(nèi)襯的 PLRP-S 色譜柱和 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)能夠適應(yīng)未來需求的原因