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摘要：監(jiān)測(cè)生物藥物的電荷異質(zhì)性對(duì)于生產(chǎn)安全有效的藥物至關(guān)重要，因?yàn)殡姾煞?布的改變可能會(huì)引起不良免疫反應(yīng)。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)展示了對(duì)利妥昔單抗創(chuàng)新藥 物及其生物仿制藥的電荷異構(gòu)體的分析。電荷異構(gòu)體在峰型模式方面表現(xiàn) 出相似性，但是創(chuàng)新藥物與生物仿制藥的單峰的強(qiáng)度則存在明顯差異。從 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色譜儀轉(zhuǎn)換為 Agilent 1260 Infinity II 生物惰 性液相色譜儀，所獲得的分析結(jié)果相當(dāng)。結(jié)果還表明保留時(shí)間具有優(yōu)異的一 致性，最大偏差小于 0.5%。兩種系統(tǒng)在保留時(shí)間和峰面積方面獲得了高精 度的結(jié)果。

 

前言：儀器間的方法轉(zhuǎn)移對(duì)不同行業(yè)的實(shí)驗(yàn) 室而言都是一項(xiàng)重要課題1 。對(duì)于制藥 及生物制藥行業(yè)中經(jīng)驗(yàn)證的方法，由 于實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)代化的發(fā)展等因素，必須 實(shí)現(xiàn)從一臺(tái)儀器到另一臺(tái)儀器的等效 方法轉(zhuǎn)換。 隨著生物制藥行業(yè)的發(fā)展，出現(xiàn)了 許多昂貴的新興單克隆抗體 (mAb) 藥 物，這導(dǎo)致了低價(jià)生物仿制藥的不斷 開發(fā)。對(duì)創(chuàng)新藥物與生物仿制藥的比 較研究對(duì)于評(píng)估生物仿制藥 mAb 的安 全性和有效性至關(guān)重要。這些廣泛的 研究包括重要的質(zhì)量屬性，例如滴度 分析、聚集研究、電荷異構(gòu)體和糖基 化分析、肽譜分析等。兩種最重要的 質(zhì)量屬性是聚集研究以及電荷異構(gòu)體 分布的分析²。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中使用的 mAb 為利妥昔單抗的創(chuàng)新藥物及生物 仿制藥，此類藥物與多藥化療法一起 用于治療彌漫大 B 細(xì)胞淋巴瘤³。 本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)使用弱陽(yáng)離子交換色譜法 (WCX) 分析了利妥昔單抗創(chuàng)新藥物及 生物仿制藥的電荷異構(gòu)體分布情況。 對(duì)兩種不同的生物惰性系統(tǒng)（Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色譜儀和 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色譜儀）進(jìn)行比較以證明所測(cè)試的兩種 系統(tǒng)的等效性。

 

實(shí)驗(yàn)部分：儀器 本實(shí)驗(yàn)在 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色譜系統(tǒng)和 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色譜系統(tǒng)上完成。該系 統(tǒng)包括以下模塊： Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液 相色譜系統(tǒng) • Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元 泵 (G5611A) • Agilent 1260 Infinity 高性能生物惰 性自動(dòng)進(jìn)樣器 (G5667A) • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1330B)，用于樣品冷卻 • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)，配備生物惰性溶劑熱 交換器 • Agilent 1260 Infinity 二極管陣列檢 測(cè)器 (G1315C)，配備 10 mm 生物 惰性標(biāo)準(zhǔn)流通池 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性四元 液相色譜系統(tǒng) • Agilent 1260 Infinity II 生物惰性泵 (G5654A) • Agilent 1260 Infinity II 生物惰性 Multisampler (G5668A)，配備樣品 冷卻裝置（選件 #100） • Agilent 1260 Infinity II 高容量恒溫 箱 (G7116A)，配備生物惰性熱交 換器（選件 #019） • Agilent 1260 Infinity II 二極管陣列 檢測(cè)器 WR (G7115A)，配備生物 惰性流通池（選件 #028）

 

色譜柱 Agilent Bio mAb，非多孔，2.1 × 250 mm， 5 µm HPLC 色譜柱，PEEK（部件號(hào) 5190-2411） 軟件 • Agilent OpenLAB CDS 2.1 版 • 安捷倫緩沖液顧問軟件 A.01.01 [009] 使用 Agilent OpenLAB CDS 2.1 版軟件 進(jìn)行液相色譜儀控制和液相色譜數(shù)據(jù) 分析。OpenLAB CDS 2.1 版軟件提供了 用于液相色譜、氣相色譜和單四極桿 質(zhì)譜的單個(gè)軟件系統(tǒng)。它具有直觀的 用戶界面，以及可采用拖放式模板創(chuàng) 建的定制化交互式報(bào)告功能。 樣品 利妥昔單抗創(chuàng)新藥物和生物仿制藥樣 品購(gòu)自印度當(dāng)?shù)氐乃幍辍?化學(xué)品 所有試劑均為液相色譜級(jí)。新制超 純水產(chǎn)自配置 0.22 μm 膜式終端過濾 器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水純化 系統(tǒng)。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和氯 化鈉購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司 (St. Louis, USA)。

 結(jié)果與討論： 離子交換色譜的方法開發(fā)通常從 pH 篩選開始，通過 pH 篩選找到分離電 荷異構(gòu)體的最佳色譜條件。在分離利 妥昔單抗電荷異構(gòu)體的過程中，選擇 磷酸鹽緩沖梯度，使用氯化鈉實(shí)現(xiàn)離 子強(qiáng)度的線性提升。能夠使磷酸鹽緩 沖液實(shí)現(xiàn)最佳緩沖容量的 pH 范圍處 于 6 至 7.5 pH 之間。因此，pH 篩選 從 pH 6.2 開始，并以 0.2 的增量逐漸 提高至 pH 7.2。圖 1 顯示了使用利妥 昔單抗生物仿制藥得到的 pH 篩選色 譜圖。根據(jù)所調(diào)節(jié)的 pH 不同，觀察 到保留時(shí)間以及分離度方面存在明顯 差異。利用安捷倫緩沖液顧問軟件計(jì) 算四元梯度，對(duì)所有調(diào)節(jié)的 pH 值采 用相同的四種儲(chǔ)備液。結(jié)合由緩沖液 顧問軟件計(jì)算得到的動(dòng)態(tài)混合四元梯 度，可縮短并簡(jiǎn)化 pH 篩選工作流程4 。 特別是，與人工配制用于預(yù)混合的雙 組分梯度的緩沖液相比，使用緩沖液 顧問軟件計(jì)算得到的動(dòng)態(tài)混合梯度能 夠顯著減少緩沖液配制時(shí)間。此外， 它可以避免中斷分析序列以引入并沖 洗新的緩沖液組分，選擇 pH 6.8 以實(shí) 現(xiàn)最高的分離度，并用于所有后續(xù)的 分析。