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毛細管 HPLC-ICP-MS 分析微升體積的植物汁液中鋅的形態(tài)
閱讀：717 發(fā)布時間：2021-3-5前言 許多金屬元素對于正常的植物生長和發(fā)育非常重要。其中一種金屬元 素就是鋅，它通常是生物體中第二豐富：的過渡金屬，并且作為重要的 微量營養(yǎng)元素在植物生理學中發(fā)揮著不同的作用。鋅是 300 多種酶的 主要成分。它負責基因調控和蛋白質結構的穩(wěn)定，包括鋅指、鋅簇和 RING 指結構域。鋅還參與光合作用和 CO2 固定等基本過程。植物中 的鋅過量或缺乏將導致植物死亡率高、生長遲緩和萎縮、萎黃病、壞 死、小葉病和開花延遲。所有這些癥狀都可能對食品安全產生嚴重影 響，因為與鋅可利用性相關的作物產量將顯著降低 [1-3]。
通過鑒定植物汁液中存在的低分子量含金屬化合 物，有助于更深入地了解植物生理學，并且確定其 準確的功能，這將進一步促進營養(yǎng)、農業(yè)和環(huán)境研 究。然而，復雜生物基質如植物樣品的研究可能在 樣品前處理或色譜分離過程中存在若干問題。主要 的挑戰(zhàn)與金屬配合物的低濃度及其多樣性有關。此 外，金屬配合物通常不穩(wěn)定，能夠在萃取、離線預 濃縮步驟、甚至色譜分離中發(fā)生降解。在迄今為止 所研究的色譜技術中，體積排阻色譜 (SEC)、親水 相互作用色譜 (HILIC) 和反相 (RP) 色譜已被證明是 適合避免金屬配合物在分析過程中發(fā)生降解的技 術 [4]。由預濃縮柱和 HILIC 或 RP 分離柱組成的色 譜系統(tǒng)似乎是此類應用的理想選擇。 本研究提出一種 ICP-MS 輔助的金屬組學方法用于 分離豌豆后韌皮部中存在的鋅形態(tài)分析。通過具有 在線預濃縮功能的毛細管 HPLC-ICP-MS 對胚囊液體 進行分析。由于植物汁液量非常少，所以需要使用 毛細管色譜
實驗部分：樣品 本文對來自發(fā)育中的豌豆豆莢（嫩豌豆）的胚囊液 體（后韌皮部）進行了研究。 樣品前處理 用玻璃毛細管在豆莢中穿孔，使用蠕動泵提取液體 胚乳，將其放入保存在冰上的 Eppendorf 管中。收 集完成后，立即將樣品置于液氮中冷凍，并在進 一步分析之前將其置于 -20 °C 的溫度下儲存。在分 析之前，將樣品解凍，并用乙腈按 1:2 的比例（樣 品：乙腈）進行稀釋，然后在 10000 rpm 的轉速下 離心 2 分鐘。收集上清液并立即進行分析。
HPLC-ICP-MS等離子體質譜系統(tǒng) 使用配備毛細管泵和手動進樣閥（定量環(huán)尺寸： 100 µL）的 Agilent 1100 液相色譜儀。將 30 µL 上清 液進樣至 SeQuant 兩性離子型 (ZIC-) HILIC 保護柱 （Merck KGaA, Darmstadt, Germany, 5 mm × 1 mm（內 徑），5 µm）中，使用 90% 乙腈和 10 mM 甲酸銨緩 沖液 (pH 5.5) 進行等度洗脫 (20 µL/min)。用流動相 將樣品清洗 4 min，然后反沖至用于化合物分離的 SeQuant ZIC-HILIC 毛細管柱（Merck KGaA, Darmstadt, Germany, 150 mm × 0.3 mm（內徑），3.5 µm）。使用 洗脫液 A（10 mM 甲酸銨緩沖液 (pH 5.5)）和洗脫液 B（乙腈），進行流速為 4 μL/min 的梯度洗脫。
使用含有 20 ppb Y、Li、Tl、Ce 溶于 2% 硝酸中的 調諧溶液，在每天開始時自動對 ICP-MS條件進行 優(yōu)化。7700x 的 ORS3 碰撞/反應池在高能量氦模式 下操作，以排除可能出現(xiàn)于 Zn 同位素中的多原子 干擾。使用 60 ms 的駐留時間采集 64Zn 和 66Zn 的信 號。ICP-MS 操作條件見表 2。
結果與討論 獲得的嫩豌豆后韌皮部的 64Zn 的色譜圖如圖 2 所 示。使用具有在線預濃縮功能的毛細管 ZIC-HILIC ICP-MS 使我們能夠獲得尖銳的高強度色譜峰，并對 兩種鋅形態(tài)進行分離和檢測（圖 2a 和 2b）。使用 ESI Orbitrap MS/MS 鑒定兩種金屬配合物。ICP-MS 檢測對于測定不同鋅形態(tài)的保留時間和估計質量平 衡至關重要。這簡化了在 ESI-MS 質譜圖中搜索鋅 配合物的步驟。質譜圖的放大部分（圖 2d 和 2e） 清晰地顯示了兩種包含鋅的同位素模式的離子。這 些提取離子色譜圖 (EIC) 的保留時間與通過毛細管ZIC-HILIC ICP-MS 觀察到的兩個鋅的峰（圖 2c）具有 良好的一致性。獲得的數(shù)據(jù)使我們能夠鑒定兩種鋅 配合物：鋅-煙草胺 (NA) 和鋅-(組氨酸)2（表 3）。
由毛細管 HPLC 和 ICP-MS 組成的色譜系統(tǒng)使我們獲 得的 64Zn（約 6 fmol 的 Zn-NA 配合物）的檢測限為 75 ng/L，該檢測限是由基線上 20 個點的標準偏差的 3 倍計算得到。將該數(shù)值與 Zn-NA 配合物的信號進 行比較，所獲得的 64Zn 的色譜柱回收率為 70-80%。
結論 ：本研究展示了一種有效的 ICP-MS 輔助的金屬組學 方法，用于分離和鑒定存在于豌豆后韌皮部中的 鋅配合物。使用 ZIC-HILIC 預柱對鋅形態(tài)進行預濃 縮，然后通過 ZIC-HILIC 毛細管柱進行分離。通過 毛細管 HPLC 與 ICP-MS 和 ESI MS/MS 儀器聯(lián)用獲 得的數(shù)據(jù)組合可用于鑒定不同的鋅配合物。由于植 物汁液量非常少，所以需要使用毛細管色譜。另 外，具有在線預濃縮功能的色譜系統(tǒng)非常適用于分 析包含低濃度金屬形態(tài)（其有時也不穩(wěn)定）的生物 樣品。本方法已成功用于鑒定兩種鋅形態(tài)：鋅-煙 草胺 (NA) 和鋅-(組氨酸)2 配合物，證明 NA 和組氨 酸是嫩豌豆后韌皮部中的兩種與鋅形成配合物的主 要配體。