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超高效二維液相色譜法準(zhǔn)確測定連翹中的連翹酯苷A和連翹苷
閱讀：758 發(fā)布時間：2021-3-2摘要 ：本文參照 2015 年版《中國藥典》，采用多中心切割超高效二維液相色譜法分析 連翹提取物中的連翹苷和連翹酯苷 A。在二次分離過程中，目標(biāo)化合物和干擾 物質(zhì)進(jìn)一步有效分離，使得測定結(jié)果更加準(zhǔn)確。由實驗結(jié)果得到，連翹酯苷 A 在 0.05-0.4 mg/mL 濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù) R2 = 0.9958 ，連翹苷在 0.01-0.2 mg/mL 濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù) R2 = 0.9999；0.1 mg/mL 混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣 6 次 考察峰面積重現(xiàn)性，連翹酯苷 A 的 RSD 為 4.2%，連翹苷 RSD 為 0.3%。
前言：中藥材、中藥提取物和中成藥的質(zhì)量優(yōu)劣多根據(jù)現(xiàn)行《中國藥典》中相關(guān)品種 的分析方法來判斷。高效液相色譜法是中藥中有效物質(zhì)或有毒有害成分常用的檢測方法。隨著《中國藥典》的不斷更新，其中的高效液相色譜方法的數(shù)量 也在不斷增加。然而，由于中藥成分的復(fù)雜性，很多藥典方法存在峰型差、分 離度不好等問題，不利于準(zhǔn)確的定量分析。 連翹，又名旱蓮子、大翹子，為木犀科植物連翹的干燥果實。2015 年版《中國 藥典》[1] 分別收載了連翹藥材和提取物兩個品種，藥材采用兩個等度方法分別 測定連翹苷和連翹酯苷 A，提取物采用特征圖譜方法同時測定連翹苷和連翹酯苷 A。本文參照 2015 年版《中國藥典》，采用多中心切割超高效二維液相色譜[2-7] 方法對連翹提取物中連翹苷和連翹酯苷 A 進(jìn)行分析，此方法大程度降低目標(biāo) 化合物受其它成分的干擾，使其定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。
實驗部分： 試劑和樣品 乙腈、甲醇和磷酸為色譜純級，購自 Sigma-Aldrich；水為 Mill-Q 純水機新制超純水；連翹酯苷 A 和連翹苷對照品、 連翹提取物為企業(yè)友情提供。 儀器和設(shè)備 本文采用 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜系統(tǒng)，其含有： • 1290 Infinity Ⅱ 二元泵（部件號 G7120A，內(nèi)置四通道脫 氣機） • 1290 Infinity Ⅱ 自動進(jìn)樣器（部件號 G7167B） • 1290 Infinity Ⅱ 柱溫箱（部件號 G7116B） • 1290 Infinity Ⅱ 二極管陣列檢測器（部件號 G7117B） • 1290 Infinity Ⅱ 二元泵（部件號 G7120A，內(nèi)置四通道脫氣 機），用于第二維分析 • 1290 Infinity Ⅱ 二極管陣列檢測器（部件號 G7117B），配 60 mm 高靈敏度流通池（部件號 G4212-60007），用于第二 維檢測 • 外置閥驅(qū)動（部件號 G1170A），3 個 • 多中心切割二維液相升級包（部件號 G4242A） • OpenLab CDS ChemStation 軟件（修訂版 C01.07[27]），用于 系統(tǒng)控制及數(shù)據(jù)處理 • 二維液相色譜采集軟件（部件號 G2198AA）：用于多中心 切割方法編輯及數(shù)據(jù)分析 系統(tǒng)配置及工作原理 系統(tǒng)配置及連接如圖 1 所示。樣品先經(jīng)第yi維色譜柱分離 后，目標(biāo)化合物通過檢測器后的雙 2 位 4 通閥的切換進(jìn)入 6 位 14 通閥所連接的樣品環(huán)，可以根據(jù)第yi維峰寬對目標(biāo) 峰進(jìn)行連續(xù)多次收集。第yi個樣品環(huán)收集完成后，即刻自 動觸發(fā)第二維的分析。同時，樣品環(huán)還可繼續(xù)收集第yi維 其它組分。
對照品溶液和供試品溶液的配制 對照品溶液：精密稱取連翹苷和連翹酯苷 A 對照品各 40.0 mg 于 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即 得 0.4 mg/mL 混合對照品溶液。將該溶液用甲醇逐級稀釋成 0.2、0.1、0.05、0.01 mg/mL 溶液，用于建立校準(zhǔn)曲線。 供試品溶液：精密稱取連翹提取物 50 mg 置于 10 mL 容量 瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻后，取 2 mL 溶液于高速離 心機，以 10000 rpm 離心 10 min，取上清液過 0.22 µm PTFE 濾膜過濾，待測。 多中心切割超高效二維液相色譜條件 多中心切割超高效二維液相色譜方法包括三部分，第yi部分 為第yi維 UHPLC 方法，第二部分為閥切換次數(shù)和時間，第三 部分為第二維 UHPLC 方法。其中，第yi部分由 OpenLab CDS ChemStation 設(shè)定，包括泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和檢測器參 數(shù)，第二和第三部分由內(nèi)置于 OpenLab CDS ChemStation 的二 維液相色譜采集軟件編輯完成。整個分析時間為 30 min。
結(jié)果與討論： HPLC 轉(zhuǎn)換為 UHPLC 2015 年版《中國藥典》中連翹提取物的分析方法為 HPLC 方法，參考該方法一次運行時間約為 80 min。按照相同填 料和兩倍線流速原則，可將 80 min 方法轉(zhuǎn)換為 18 min 的 UHPLC 方法，如圖 2 所示。綜觀 HPLC 和 UHPLC 色譜圖， 兩種方法的分離譜圖相似，且 UHPLC 時間的縮短并未損失 HPLC 獲得的分離度，如 HPLC 色譜圖中連翹苷出峰前的干 擾峰在 UHPLC 上也得到明顯分離。