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采用高效液相色譜法測定食品中的水溶性著色劑
閱讀：1093 發(fā)布時(shí)間：2021-1-19摘要：本文采用乙腈-氨水溶液提取、Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱富集和凈化、Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱快速分離，建立了同時(shí)檢測食品中 9 種常用水溶性著色劑的液相色譜分析方法。該方法在 2.5-50 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù) R2 ≥ 0.9998。對于冰淇淋和火腿腸這兩種基質(zhì)，加標(biāo)濃度為 2.5 mg/kg 和 5.0 mg/kg 的 9 種著色劑的平均回收率均處于 62.0%-117.3% 的范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.4%-19.9% (n = 3)。9 種著色劑的方法檢測限 ≤ 0.083 mg/kg，在 15 min 內(nèi)即可完成快速分離與高靈敏度分析。
前言：合成著色劑通常由苯、甲苯、萘等化工原料經(jīng)過一系列有機(jī)反應(yīng)獲得，以價(jià)格低廉、染色性能好且用量少等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于加工食品。對于加工食品中的著色劑，我國現(xiàn)行*和檢測方法分別為《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2014)[1] 和《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》(GB 5009.35-2016)[2]。其中 GB 5009.35- 2016 規(guī)定的樣品前處理方法包括聚酰胺吸附法和液-液分配法，這兩種方法操作過程繁瑣，且對高脂肪、高蛋白的樣品提取效果不佳。本文采用 Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱建立了食品中常用水溶性著色劑的樣品前處理方法，在對冰淇淋和火腿腸樣品中的 9 種水溶性著色劑的分析中獲得了良好的結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)部分：試劑和樣品實(shí)驗(yàn)所用試劑和溶劑均為色譜純或分析純級。色譜純乙腈、甲醇購于迪馬公司，9 種著色劑標(biāo)準(zhǔn)品（檸檬黃、桔黃、靛藍(lán)、亮藍(lán)、莧菜紅、胭脂紅、新紅和酸性紅）購于 Dr. Ehrenstorfer 公司，實(shí)驗(yàn)用水為 Millipore Milli-Q 超純水系統(tǒng)現(xiàn)制備的高純?nèi)ルx子水。冰淇淋和火腿腸樣品為市售產(chǎn)品。儀器和設(shè)備 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統(tǒng)，配備以下模塊： – Agilent 1260 Infinity 二元泵（部件號 G4220A） – Agilent 1260 Infinity 標(biāo)準(zhǔn)自動進(jìn)樣器（部件號 G4226A） – Agilent 1260 Infinity 柱溫箱（部件號 G1316C） – Agilent 1260 Infinity 二極管陣列檢測器（部件號 G4212A）
樣品提取與凈化：取 1.0 (±0.1) g 食品樣品于具塞離心管中，加 10 mL 提取液（濃氨水:水:乙腈=2:23:75，v/v/v）振搖提取 2 min，4 °C 8000 r/min 離心 10 min，取 5 mL 上清液至另一具塞離心管中并加 10 mL 水混勻，用甲酸調(diào)節(jié) pH 至 2.0，4 °C 8000 r/min 離心 10 min，取上清液待凈化。采用 Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱（部件號 12102042）進(jìn)行凈化，操作流程如圖 1 所示。
液相色譜條件色譜柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18, 4.6 × 100 mm, 2.7 μm （部件號 695975-902）柱溫： 35 °C 進(jìn)樣量： 10 μL 流動相： A) 20 mmol/L 乙酸銨水溶液（用乙酸將 pH 調(diào)節(jié)至 5.0） B) 乙腈流速： 1.0 mL/min 梯度洗脫： 時(shí)間 (min) B（%） 0.0 2 6.0 30 11.0 90 11.5 100 12.0 2 15.0 2 檢測波長： 425 nm 檸檬黃 630 nm 靛藍(lán)、亮藍(lán) 500 nm 新紅、莧菜紅、胭脂紅、桔黃、酸性紅
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以超純水為溶劑，分別取一定量的著色劑標(biāo)準(zhǔn)品，配制得到濃度分別為 2.5、5.0、10.0、25.0 和 50.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取 10 μL 各種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，分別以 9 種著色劑在特定波長下的峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
結(jié)果與討論提取液優(yōu)化本文采用乙腈比例較高的堿性溶液（濃氨水:水:乙腈=2:23:75， v/v/v）提取冰淇淋和火腿腸中的水溶性著色劑，以便獲得高的提取效率。如果待測食品中的油脂含量不高，也可適當(dāng)調(diào)整為采用水比例更高的提取液。固相萃取方法優(yōu)化由于 9 種水溶性著色劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)和磺酸根基團(tuán)，因此本文分別考察了非極性、強(qiáng)陰離子交換和弱陰離子交換三種固相萃取吸附模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)弱陰離子交換固相萃取在吸附強(qiáng)度和重現(xiàn)性方面表現(xiàn)出色，故選擇弱陰離子交換模式來萃取和凈化食品中的水溶性著色劑。為確保 9 種著色劑實(shí)現(xiàn)可靠的回收，本文針對提取液、活化液、上樣液、淋洗液、洗脫液的 pH 和離子強(qiáng)度均進(jìn)行了細(xì)致的優(yōu)化，終確定的固相萃取流程如圖 1 所示。色譜條件選擇本文選擇常用的十八烷基鍵合硅膠色譜柱進(jìn)行液相色譜分離[2、3、4] ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜柱填料是否封端以及流動相的 pH 對著色劑（尤其是莧菜紅、檸檬黃和胭脂紅）的峰形影響顯著，其原因可能在于強(qiáng)陰離子磺酸根容易導(dǎo)致次級相互作用。因此，終選擇經(jīng)過充分封端的 Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，并將乙酸銨緩沖液的 pH 調(diào)節(jié)至 5.0，由此有效抑制了峰拖尾現(xiàn)象，使 9 種著色劑均可獲得優(yōu)異的峰形，同時(shí)提高了分離度。檢測波長的確定通過二極管陣列檢測器全光譜采集，確定 9 種著色劑的檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管 9 種著色劑在 254 nm 波長下的響應(yīng)較高，但基線波動和雜質(zhì)峰干擾現(xiàn)象較明顯，在可見波長下則具有更高的選擇性。1.25 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖 2 所示， 9 種著色劑的檢測波長分別為：檸檬黃，425 nm；靛藍(lán)和亮藍(lán)，630 nm；新紅、莧菜紅、胭脂紅、桔黃和酸性紅， 500 nm。