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摘要：細(xì)胞脂肪酸 (FA) 譜被*為各種人類疾病的生物標(biāo)記物，通常采用安捷倫氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) (GC/MS) 對(duì)其進(jìn)行分析，而這種方法非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此臨床研究中需要一種高通量的分析方法。在本研究中，從紅細(xì)胞 (RBC) 中提取 FA 后進(jìn)行衍生化，以生成脂肪酸甲酯 (FAME)。采用氨氣誘導(dǎo)化學(xué)電離 (CI) 的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (GC/MS/MS) FA 譜分析法專為人 RBC 的分析而開(kāi)發(fā)。有 703 個(gè) RBC 樣品采用 GC/MS/MS 進(jìn)行了 FA 譜分析。將該分析方法與采用電子轟擊電離 (EI) 的單桿 GC/MS 傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較。氨氣誘導(dǎo) CI 分析能夠生成足夠數(shù)量的分子離子，以對(duì) FAME 進(jìn)行進(jìn)一步研究。該分析確定了 45 個(gè) FA 譜的特定碎片，用于實(shí)現(xiàn)可靠的定量分析和碎裂。使用傳統(tǒng) GC/MS 的典型分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá) 60 分鐘，但該 GC/MS/MS 分析方法的運(yùn)行時(shí)間僅為 9 分鐘。分析的所有 FA 批間與批內(nèi)變異小于 10%。將氨氣誘導(dǎo) CI 與 GC/MS/MS 分析相結(jié)合，可幫助臨床研究實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、可靠的高通量 FA 譜分析。

 

前言為了測(cè)定臨床研究實(shí)驗(yàn)室中的脂肪酸 (FA) 譜，需要靈敏的特異分析方法。過(guò)去分離 FA 譜采用的是氣相色譜 (GC) 結(jié)合火焰離子化檢測(cè)器 (FID)，這個(gè)組合使研究人員能夠分析不同基質(zhì)中的單個(gè) FA1 。質(zhì)譜 (MS) 的引入改善了這種分析方式2 ，但傳統(tǒng) GC/MS 分析需要長(zhǎng)時(shí)間的色譜分離才能確保可靠的鑒定和定量。本研究開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種用于紅細(xì)胞 (RBC) 等生物樣本中 FA 高通量分析的特異、快速而靈敏的分析方法。為此，使用化學(xué)電離 (CI) 與氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (GC/MS/MS) 結(jié)合來(lái)測(cè)定 FA。采用這些技術(shù)可得到過(guò)去使用 GC/MS 進(jìn)行 FA 分析的改進(jìn)方法。

 

化學(xué)品與試劑異丙醇、甲醇和己烷（GC 級(jí)）購(gòu)自 Fisher Scientific (Schwerte, Germany)。水（LC/MS 級(jí)）和BF314% 甲醇溶液）購(gòu)自 Sigma-Aldrich (Hamburg, Germany)。硫酸鈉 (Na2SO4) 購(gòu)自 Merck (Darmstadt, Germany)。經(jīng)認(rèn)證的 37 種脂肪酸甲酯 (FAME) 混合物 (TraceCERT) 購(gòu)自 Sigma-Aldrich (Hamburg, Germany)。另一種 FAME 混合物購(gòu)自 NuChekPrep (Elysian, MN, USA)，包括內(nèi)標(biāo) C17:1（十七碳烯酸甲酯）在內(nèi)的所有其他 FAME 均購(gòu)自 Larodan (Malmö, Sweden)。使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室分析提交的 EDTA 抗凝血液等分試樣。按照 “赫爾辛基宣言 II”向受試者詳細(xì)說(shuō)明，并獲得使用不具名實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的知情同意。

 

樣品前處理為從血紅細(xì)胞中提取 FA，將 0.5 mL 全血和 10 mL 0.9% 鹽水混合，并在 2500 g 下離心 5 分鐘。棄去上清液后，重復(fù)一次清洗步驟。之后加入 1 mL 蒸餾水使細(xì)胞溶解，并在冰箱的低溫條件中儲(chǔ)存至少 30 分鐘。然后將 FA 提取物與 5 mL 內(nèi)標(biāo) (IS) 溶液混合，并在 2500 g 下離心 5 分鐘。IS 溶液含有 0.2 mg/mL FAC17:1 己烷/異丙醇 (3:2) 溶液以及 3 mL Na2SO4 溶液 (6.7%)。然后將己烷相轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃管中并用氮?dú)鈱悠氛舾?。在分離 FA 時(shí)，加入 1 mL BF3 甲醇溶液 (14%) 并在 100 °C 下溫育 10 分鐘進(jìn)行酯化。然后，冷卻至室溫后，將 1 mL 水和 3 mL 己烷加入樣品中，并在 2500 g 下離心 5 分鐘。將己烷相轉(zhuǎn)移至干凈的樣品瓶中，用氮?dú)庹舾?。終的 FAME 樣品溶于 250 mL 己烷中，可儲(chǔ)存在 –25 °C 條件下。分析前將樣品以 1:20 的比例用己烷稀釋。數(shù)據(jù)分析采用 Agilent MassHunter 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集 (Waldbronn, Germany)。為了對(duì) FAME 進(jìn)行正確鑒定和定量，用兩個(gè)碎片離子，一個(gè)用于定量，另一個(gè)用于確認(rèn)。校準(zhǔn)標(biāo)樣中采用 45 種 FAME（表 1）的混合物。將單個(gè) FA 濃度計(jì)算為評(píng)估的 FA 集合中 100% 的相對(duì)百分比，或計(jì)算為值。采用 MassHunter 定量分析軟件 5.0 和 MassHunter 定性分析軟件 5.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值計(jì)算校準(zhǔn)曲線。方法參數(shù)為了測(cè)定 GC/MS/MS 分析方法的線性和準(zhǔn)確性，使用了 45 種 FAME 混標(biāo)在己烷和混合人紅細(xì)胞中的一系列稀釋溶液。方法的準(zhǔn)確性同樣用 45 種 FAME 混標(biāo)在三個(gè)不同濃度范圍內(nèi)進(jìn)行評(píng)估。為了評(píng)估批內(nèi)精度，對(duì)一份人血液混合樣品的 10 個(gè)等分獨(dú)立樣品進(jìn)行分析。以相同方式測(cè)定批間精度，但將樣品分散在不同天中測(cè)定。使用在分析當(dāng)天配制的校準(zhǔn)標(biāo)樣測(cè)定濃度。計(jì)算精度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。對(duì)人血樣品的分析靈敏度重復(fù)測(cè)定 10 次。根據(jù)所選分析物的信噪比 (S/N) 計(jì)算檢測(cè)限 (LOD) 和定量下限 (LLOQ)。使用 MassHunter 定性分析軟件計(jì)算信噪比。

 

結(jié)果與討論 安捷倫GC/MS 分析為比較 EI 和 CI 兩種電離方法，在 FAME 分析中展示了二十二碳六烯酸甲酯（DHA，C22:6n3）的譜圖。圖 1A 中，采用 EI 的 GC/MS 譜圖顯示出大量低質(zhì)量數(shù)碎片。m/z = 67、m/z = 79 和 m/z = 99 等某些碎片是 LC-PUFA 的特征性碎片，而這些碎片不具有化合物特異性。采用 EI 碎裂方式后，通常無(wú)法檢出 FAME 的分子離子。相反，采用 CI 時(shí)，GC/MS 譜圖中主要的峰為分子離子 ([M+H]+ )，m/z = 343（圖 1B）。氨氣用作 CI 的反應(yīng)氣，因此其他的主要峰為氨加合離子 ([M+NH4] + )， m/z = 360。兩種碎片都具有化合物特異性，因?yàn)?MS/MS 模式中消耗的氨（[M+NH4] + & [M+H]+ ）可用作定量離子對(duì)。