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采用 LC/QQQ 法測定雞肉中的甲硝唑
閱讀：1019 發(fā)布時(shí)間：2020-11-18前言： 甲硝唑 (Metronidazole, MTZ) 是畜牧業(yè)生產(chǎn)中常用的一種硝基咪唑類藥物，具有抗厭氧菌 和抗原蟲作用，主要用于治療雞、火雞的組織滴蟲病、牛毛滴蟲病，還可與其它抗生素聯(lián) 合，用于治療厭氧菌感染。但研究表明，該物質(zhì)對人體具有神經(jīng)毒性和潛在致癌性。鑒于 此，歐盟和美國食品藥品監(jiān)督管理局禁止在動(dòng)物源性食品中使用甲硝唑等硝基咪唑類藥 物。2002 年 12 月，我國農(nóng)業(yè)部修訂了《動(dòng)物性食品中獸藥高殘留*》，規(guī)定可使用 甲硝唑治療動(dòng)物疾病，但禁止以抗應(yīng)激、提高飼料報(bào)酬、促生長為目的將該藥物用于所有 食品動(dòng)物，并規(guī)定所有食品動(dòng)物可食性組織中甲硝唑的高殘留*為零。為保障食品安 全，建立動(dòng)物性食品中甲硝唑殘留的檢測方法勢在必行。 本研究利用 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱凈化雞肉樣品，并使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)/ 6460 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析樣品中的甲硝唑殘留。
甲硝唑分析 對試料進(jìn)行樣品前處理。從所取全部樣品中取出可食部分約 500 g，剔除筋膜，用組織 勻漿機(jī)充分搗碎均勻，轉(zhuǎn)入潔凈容器中，密封并標(biāo)記，于 –18 °C 以下冷凍存放。稱取均 質(zhì)樣品 4 g（至 0.01 g）于 50 mL 具塞聚丙烯塑料離心管中，加入 40 μL 200 μg/L 同位素內(nèi)標(biāo)工作液（將甲硝唑13C2- 15N2 標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇從而完成制備），加入 4 mL 4% 氯化鈉水溶液（分析純度），渦旋混勻，超聲處理 5 min，加入 20mL 乙酸乙酯（色譜純 度）提取，渦旋混勻，9000 r/min 4 °C 離心 5 min，取 5 mL 上清液于 40 °C 氮?dú)庀麓?干，用 5 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液復(fù)溶待凈化。使用 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱對所得樣品提取液 進(jìn)行凈化和富集，具體操作如下：Plexa PCX 固相萃取柱依次 用 5 mL 甲醇和 5 mL 純水活化。將 5 mL 樣品提取液分兩次過 柱，依次用 0.1% 甲酸（色譜純度）水溶液和甲醇（色譜純度） 各 5 mL 淋洗，抽干柱子，用濾紙將柱子擦干凈，用 5 mL 5% 氨 化甲醇分兩次洗脫，收集洗脫液，40 °C 氮?dú)獯抵两?，?1 mL 流動(dòng)相重新溶解，過 0.2 μm Agilent Captiva RC 濾膜后，供儀器 測定。 隨后，使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)/6460 三重四極 桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)對其中的甲硝唑殘留進(jìn)行分析。液相色譜條件和 梯度程序如表 1 所示，質(zhì)譜分析條件和部分質(zhì)譜儀參數(shù)分別如 表 2 和表 3 所示。
本文采用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)法定量。用甲醇溶解甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品， 制備得到 100 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作液，并逐級(jí)稀釋、配制得到 0.1、 0.25、0.5、1.0、2.5、5、10 μg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入內(nèi)標(biāo) 工作液（同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)為甲硝唑13C2- 15N2），使內(nèi)標(biāo)濃度均為 2.0 μg/L。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，待測組分與內(nèi)標(biāo)物的峰面 積之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中甲硝唑的含 量。通過繪制曲線得到，在 0.1–10 µg/L 線性范圍內(nèi)，甲硝唑的 線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù) r > 0.995。
樣品中待測物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間一 致，變化范圍應(yīng)在 ±2.5% 之內(nèi)。待測化合物定性離子的重構(gòu)離 子色譜峰的信噪比 (S/N) ≥ 3，定量離子重構(gòu)離子色譜峰的信噪 比 (S/N) ≥ 10。同一檢測批次，樣品中的兩個(gè)子離子的相對豐度 比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，各離子對的相對豐度應(yīng)與校準(zhǔn)溶 液的相對豐度一致，誤差不超過表 4 中規(guī)定的范圍。質(zhì)譜分析所 得的色譜質(zhì)譜圖如圖 1 所示，樣品及樣品加標(biāo)總離子流圖如圖 2
在 0.5、1、2 μg/kg 的加標(biāo)濃度下，每個(gè)加標(biāo)濃度平行測定 6 次，進(jìn)行方法回收率討論。如表 5 所示，甲硝唑的回收率為 78%–96%，RDS ≤ 6.1%，表明該方法的回收率和精度*甲 硝唑的定量分析要求。 每 10 個(gè)樣品測定 1 個(gè)加標(biāo)回收率，樣品數(shù)小于 10 個(gè)，至少測定 1 個(gè)加標(biāo)回收率。回收率實(shí)驗(yàn)采用 0.5、1、2 μg/kg 三個(gè)加標(biāo)濃 度，每個(gè)加標(biāo)濃度平行測定 6 次，回收率和精度見表 5。通過對 加標(biāo)樣品的總離子流圖進(jìn)一步分析得到，按 3 倍信噪比測得的檢 測限 (LOD) 為 0.5 µg/kg，以 10 倍信噪比測得的定量限 (LOQ) 為 1.5 µg/kg。
本文所述使用 Bond Elut PCX 固相萃取柱和 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)/6460 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析雞肉樣品中甲硝唑的 方法線性范圍寬、樣品回收率高、質(zhì)譜信號(hào)良好，而且具有優(yōu)異 的檢測限 (LOD) 和定量限 (LOQ)，在動(dòng)物性食品獸藥殘留分析領(lǐng) 域有很好的應(yīng)用前景。