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使用親水相互作用色譜 與LC/MS/MS 分析膽堿代謝物
閱讀：1001 發(fā)布時間：2020-11-3摘要:使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 和 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-OH5 色譜柱分析膽堿及其代謝物。與 Poroshell 120 HILIC-OH5 相比， Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱可提供更好的峰形和略高的靈敏度，但是保留性能較弱。本文使用 Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱考察不同流動相添加劑的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在流動相中添加 10 mmol/L 乙酸銨可以獲得峰形。
前言:膽堿及其代謝物甜菜堿、乙酰膽堿和甘油磷酰膽堿屬于小分子強極性季胺化合物，無法在反相色譜柱上保留。新開發(fā)的 HILIC 化學鍵合相采用表面多孔顆粒填料技術(shù)，是保留這類化合物的理想選擇。在本應用簡報中，使用 InfinityLab Poroshell 120 HILIC-OH5 和 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 化學鍵合相色譜柱對膽堿及其代謝物進行分離。使用 Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱考察不同流動相添加劑的影響。Agilent 6460 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)用于低濃度樣品的檢測。
實驗部分:試劑與化學品所有試劑均為 HPLC 級或更高等級。 HPLC 級乙腈購自 J. T. Baker (Center Valley, PA, USA)。水經(jīng)由 ELGA PURELAB Chorus 系統(tǒng) (High Wycombe, UK) 純化。甲酸、乙酸、乙酸銨和氫氧化銨購自北京百靈威科技有限公司。膽堿、甜菜堿、乙酰膽堿和甘油磷酰膽堿購自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。標準溶液用 90:10 乙腈:水溶液配制而成，濃度為 0.5 nmol/L。
儀器與材料 • 色譜柱入口：Agilent InfinityLab Quick Connect 快速連接液相色譜接頭（部件號 5067-5965） • 色譜柱出口：Agilent InfinityLab Quick Turn 液相色譜接頭（部件號 5067-5966） • Agilent Captiva 經(jīng)濟型過濾器，PTFE 膜，直徑 13 mm，孔徑 0.2 µm（部件號 5190-5265） • 安捷倫樣品瓶，螺口蓋，棕色，帶書寫簽，經(jīng)認證，2 mL（部件號 5182- 0716） • 安捷倫固定螺口蓋，藍色，帶 PTFE/ 紅色硅膠隔墊（部件號 5190-7024） • Agilent InfinityLab 溶劑瓶，棕色， 1000 mL（部件號 9301-6526）Agilent InfinityLab Stay Safe 溶劑瓶安全蓋，GL45，3 口，1 個放空閥（部件號 5043-1219） • Eppendorf 移液器和連續(xù)分液器 • 超聲儀 (VWR, Radnor, PA, USA)
儀器 • Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B) • Agilent 1290 Infinity II MCT (G7116B) • Agilent 6460 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) (G6460A) • Agilent MassHunter LC/MS 數(shù)據(jù)采集軟件，版本 B.08.00 軟件 Agilent MassHunter 定性分析軟件，版本 B.07.00
結(jié)果與討論:如圖 2 所示，考察了不同的流動相添加劑。隨著流動相 pH 值增加，乙酰膽堿和膽堿在 Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱上的保留能力增強，但是響應信號稍有降低。當使用中性或堿性流動相時，它們的保留能力保持不變。然而，在中性 pH 值流動相條件下，乙酰膽堿和甜菜堿的信號強度均比堿性條件下高。因此在流動相中添加 10 mmol/L 乙酸銨能夠為四種化合物提供好的分離。
在相同中性 pH 值流動相的條件下，對比了兩種 HILIC 色譜柱的分離效果。 Poroshell 120 HILIC-OH5 色譜柱的分析結(jié)果顯示所有化合物的保留性能均有所增強，出峰順序發(fā)生改變，甜菜堿的靈敏度提高。然而，Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱能夠為關(guān)鍵分析物乙酰膽堿和膽堿提供更好的峰形。
結(jié)論總體來說，在中性 pH 值條件下使用添加乙酸銨的流動相以及 InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱可以實現(xiàn)膽堿及其代謝物的分離。對另一種不同的 HILIC 化學鍵合相（即 InfinityLab Poroshell 120 HILIC-OH5）也同樣進行了分離性能的評估。甜菜堿的靈敏度在 HILIC-OH5 色譜柱上得到了提高，然而乙酰膽堿和膽堿的峰形和靈敏度在 HILIC-Z 色譜柱上更出色。