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使用HILIC LC/MS 對哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基進行監(jiān)測
閱讀：987 發(fā)布時間：2020-10-27摘要：將 Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-Z 色譜柱與 Agilent 6545 Q-TOF LC/MS 結(jié)合使用，對六天內(nèi)采集的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中的養(yǎng)分吸收和分泌廢物進行監(jiān)測。 HILIC-Z 色譜柱可保持良好的峰形與保留時間重現(xiàn)性，能適應(yīng)高鹽樣品（如細(xì)胞培養(yǎng)基）。該方法通過優(yōu)化流動相、梯度和儀器參數(shù)，可用于在負(fù)離子模式下的單次分析運行中對生長培養(yǎng)基的養(yǎng)分（即葡萄糖和氨基酸）與代謝廢物（即乳酸及 TCA 循環(huán)相關(guān)的其他有機酸）進行監(jiān)測。
前言：質(zhì)譜 (MS) 是一種高靈敏度分析技術(shù)，常用于針對各種小分子的代謝組學(xué)研究1 。哺乳動物細(xì)胞代謝組學(xué)一躍成為在多個研究領(lǐng)域中具備應(yīng)用潛力的新興工具，研究細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞消耗與分泌的多種代謝物變得越來越重要2,3。分析仍然面臨一些挑戰(zhàn)，包括陰離子代謝物的保留4 、樣品基質(zhì)效應(yīng)5 ，以及螯合有機酸和磷酸化合物的分析性能6 。為應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，開發(fā)了一種穩(wěn)定且可重現(xiàn)的親水相互作用色譜 (HILIC) LC/MS 方法，方法中采用 InfinityLab 去活劑添加劑作為流動相改性劑，以增強金屬螯合有機酸和磷酸化分析物的峰形和檢測信號。作為色譜優(yōu)化與 HILIC 色譜柱測試的一個步驟，對樣品基質(zhì)中鹽濃度的影響進行了研究。研究中建立了一種分析細(xì)胞生長培養(yǎng)基中代謝物消耗和分泌的方法。
實驗部分：方法耐鹽性研究：為進行 HILIC LC/MS 方法開發(fā)，選擇了一套涵蓋磷酸化分析物與磷酸糖異構(gòu)體的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品。使用 Milli-Q 純化水配制 5 mg/mL 的分析物儲備液。然后用 80:20 的乙腈 (ACN)/水將儲備液稀釋為 1 ng/µL (ppm) 的樣品。在實驗中，配制一份高鹽儲備液（4 mol/L 尿素和 2 mol/L 氯化鈉 (NaCl) 水溶液）作為鹽加標(biāo)樣。將高鹽溶液按 20% （80 mmol/L 尿素、40 mmol/L NaCl）與 40%（160 mmol/L 尿素、80 mmol/L NaCl）加標(biāo)至代謝物標(biāo)準(zhǔn)品 (3 ng) 中。因為鹽不溶于樣品基質(zhì) (80% ACN)，因此沒有嘗試采用更高的鹽濃度 (> 40%)。細(xì)胞培養(yǎng)研究：在添加 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng) K562 白血病細(xì)胞。立即（第 0 天）、24 小時（第 1 天）、48 小時（第 2 天）、72 小時（第 3 天）或 6 天（第 6 天）后采集部分細(xì)胞和培養(yǎng)基。將樣品在 250 × g 條件下離心 5 分鐘，使細(xì)胞形成團塊。將生長培養(yǎng)基 (100 µL) 轉(zhuǎn)移至另一個離心管，與 400 µL 50% ACN 混合，再在 10000 × g 條件下離心 5 分鐘。然后，對 1 µL 上清液進行 HILIC LC/MS 分析。使用 Agilent MassHunter 定量分析軟件分析結(jié)果。
分析物分離：在 InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, 2.1 mm × 50 mm, 2.7 µm, PEEK 內(nèi)襯（部件號 679775-924）色譜柱上進行色譜分離。首先配制一份 10 倍流動相緩沖儲備液（100 mmol/L 乙酸銨， pH 9.0）水溶液，然后用水（A 溶液）或 ACN（B 溶液）配制 1 倍溶劑。在水溶液和有機流動相中添加 InfinityLab 去活劑添加劑（部件號 5191-4506），確保濃度在梯度洗脫過程中保持不變。儀器使用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜儀與配備安捷倫噴射流離子源的 Agilent 6545 Q-TOF 的聯(lián)用系統(tǒng)進行 LC/MS 分析。液相色譜儀包括： • 帶清洗密封墊的 Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • 帶柱溫箱 (G1330B) 的 Agilent 1290 Infinity 自動進樣器 (G4226A) • 安捷倫柱溫箱 (G1316C) 通過連續(xù)注入?yún)⒈荣|(zhì)量溶液，實現(xiàn)動態(tài)質(zhì)量軸校準(zhǔn)。表 1 和表 2 匯總了優(yōu)化的 LC 和 MS 條件。使用 Agilent MassHunter 軟件套件進行數(shù)據(jù)采集與分析。
結(jié)果與討論：利用 InfinityLab Poroshell HILIC-Z 色譜柱寬范圍的 pH 穩(wěn)定性與高分離度，開發(fā)了一種簡單而穩(wěn)定的 HILIC LC/MS 方法。在本研究中，pH 9.0 的流動相在色譜分離中獲得了整總體結(jié)果。此外，添加 InfinityLab 去活劑添加劑明顯改善了鰲合有機酸與磷酸化合物的峰形，同時增強了信號強度。在 DMEM 與 RPMI 1640 這兩種常用的培養(yǎng)基中，含有的高濃度無機鹽包括（NaCl，約 100 mmol/L）、（KCl，約 5 mmol/L）和硝酸鈣（Ca(NO3)2，約 0.4 mmol/L）。這些無機鹽可保持培養(yǎng)基滲透平衡，并有助于調(diào)節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的膜電位。為確定鹽對保留時間重現(xiàn)性與代謝物峰形的影響，我們使用 HILIC LC/MS 方法對濃度增加的尿素和 NaCl 加標(biāo)樣品進行分析（圖 1）。結(jié)果表明，HILIC 色譜柱保持了保留時間重現(xiàn)性，同時高鹽樣品中的目標(biāo)核苷酸（如 AMP、ADP、ATP 和 GTP）與磷酸糖異構(gòu)體（如葡萄糖-1-磷酸鹽和葡萄糖-6-磷酸鹽）檢測到極小的離子抑制（圖 1）。
接下來，我們設(shè)計了一項實驗，用于監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)基在六天時間內(nèi)的養(yǎng)分消耗與代謝物分泌（圖 2）。在生長培養(yǎng)基中，乳酸作為代謝廢物，隨時間推移而逐漸積累（圖 3，第 1 列）。此外，在監(jiān)測過程中，有關(guān) TCA 循環(huán)的其他有機酸（即蘋果酸、α-酮戊二酸 (α-KG)、谷氨酸和檸檬酸）在生長培養(yǎng)基中分泌并逐漸累積（圖 3）。相比之下，細(xì)胞在代謝過程中消耗了糖，因此葡萄糖濃度隨時間推移逐漸降低（圖 3，第 2 列），直至*耗盡（圖 3，第 2 列，第 6 天）。氨基酸濃度也隨時間推移而逐漸降低，這是因為細(xì)胞消耗了生長培養(yǎng)基中的養(yǎng)分（圖 4）。結(jié)果表明，在單次 HILIC LC/MS 運行中，可對哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中包括有機酸與氨基酸在內(nèi)的各種代謝物進行分析和監(jiān)測。