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用于抗體藥物偶聯(lián)物 （ADC）藥物/抗體比率 （DAR） 分析的色譜柱
閱讀：2080 發(fā)布時(shí)間：2020-10-10摘要：本應(yīng)用簡報(bào)介紹了 AdvanceBio HIC 色譜柱的特性及其在抗體藥物偶聯(lián)物 (ADC) 分析中的應(yīng)用。疏水相互作用色譜 (HIC) 是一種分離相互間疏水性逐漸增加的生物分子的方法。這種技術(shù)非常適合用于 ADC 的分析，因?yàn)檫@些復(fù)雜分子的疏水性通常高于未修飾的抗體。該技術(shù)可提供高分離度，能夠分離具有細(xì)微疏水性差異的物質(zhì)，包括那些具有不同藥物/抗體比率 (DAR) 的 ADC。HIC 的優(yōu)點(diǎn)之一在于洗脫所用的條件溫和，可確保生物分子保持在未變性狀態(tài)。這有利于對半胱氨酸連接的 ADC 的分析。
前言： HIC 使用含鹽流動(dòng)相以減小生物分子溶解度，有利于這些分子吸附到 HIC 固定相上。通過梯度洗脫減小鹽濃度，能夠使分子按照疏水性逐漸增加的順序洗脫。分離過程類似于反相色譜，但是無需使用通常會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的離子對試劑和高濃度有機(jī)溶劑組分。這對分析通過半胱氨酸連接的 ADC 來說非常重要。用作有效載荷的小分子連接到部分還原的單克隆抗體 (mAb) 的自由巰基上，但這會(huì)導(dǎo)致多分散分布（圖 1）。測量這種分布（稱為 DAR）對于確定所獲得的 ADC 的效價(jià)至關(guān)重要。
實(shí)驗(yàn)部分：儀器與材料所有化學(xué)品和試劑均為 HPLC 級或更高級別，且均購自 Sigma-Aldrich（現(xiàn)屬于 Merck）或 VWR Scientific。水經(jīng)由 Milli-Q A10 水純化系統(tǒng) (Millipore) 純化。儀器 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色譜儀包括： • Agilent 1260 Infinity II 生物惰性泵 (G5654A) • Agilent 1260 Infinity II 生物惰性 Multisampler (G5668A)，配備樣品冷卻裝置（選件編號(hào) 100） • Agilent 1260 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116A)，配備生物惰性熱交換器（選件編號(hào) 019） • Agilent 1260 Infinity II 二極管陣列檢測器 WR (G7115A)，配備生物惰性流通池（選件編號(hào) 028）
在樣品前處理過程中應(yīng)小心操作，以確保樣品*溶解且不存在 DAR 異構(gòu)體歧視；DAR 0 的親水性高于 DAR 8，并且能夠選擇性地溶解于流動(dòng)相中。如果所有樣品未*溶解，則會(huì)導(dǎo)致誤差。在流動(dòng)相條件中包括異丙醇梯度非常重要，否則 DAR 6 和 DAR 8 異構(gòu)體將可能吸附到色譜柱上。圖 3A、3B 和 3C 表明，在異丙醇濃度不足的情況下，疏水性較強(qiáng)的 DAR 6 和 DAR 8 異構(gòu)體被保留。
結(jié)果與討論 ：HIC 中使用的高濃度鹽意味著采用全生物惰性液相色譜是非常有利的。如果附帶密封墊清洗和進(jìn)樣針清洗等避免鹽析問題的附加功能，那么將更加有利。然而，避免使液相色譜系統(tǒng)或色譜柱暴露于高濃度鹽溶液中仍然很重要。因此，采用四元液相色譜系統(tǒng)使其他通道能夠用于有機(jī)改性劑和水或其他沖洗溶劑。與 mAb 偶聯(lián)的疏水性藥物小分子的存在導(dǎo)致 mAb 分子的總體疏水性發(fā)生顯著改變。因此，需要在流動(dòng)相中添加一些有機(jī)改性劑（參見方法條件和梯度曲線部分）。使用 HIC 能夠分析處于完整狀態(tài)的半胱氨酸連接的 ADC（圖 2）。如果采用反相技術(shù)，將會(huì)分離未通過半胱氨酸鍵連接的重鏈和輕鏈。反相色譜可用于分析半胱氨酸連接的 ADC，但是僅在這些分子*還原的情況下才能實(shí)現(xiàn)1 。
結(jié)論我們已經(jīng)證明，通過控制流動(dòng)相組成并選擇合適的流速和色譜柱尺寸，能夠使用 AdvanceBio HIC 色譜柱快速準(zhǔn)確地分析 ADC 的 DAR 值。