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應(yīng)用優(yōu)勢 ■ 快速定量血漿和血清中的24種神經(jīng)酰胺、 23種己糖基神經(jīng)酰胺以及鞘氨醇 ■ 使用Quanpedia™和SOP構(gòu)建性能穩(wěn)定、便于部署的平臺，降低方法開發(fā)和培訓(xùn)成本 ■ 使用TargetLynx™軟件和第三方信息學(xué)軟件（即Skyline）實現(xiàn)快速數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)可視化 ■ 比同類工作流程更快、更經(jīng)濟(jì)

簡介鞘脂(SLs)是脂質(zhì)中的一類，包括神經(jīng)酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)和較為復(fù)雜的鞘糖脂。所有SLs都有一條“長鏈”，也就是鞘氨醇堿基鏈1 。這些堿基是鞘氨醇(SPH)等有機脂肪族氨基醇或者結(jié)構(gòu)相似化合物（圖1）。這些化合物是細(xì)胞膜的重要組成部分，與多種生物功能有關(guān)，包括細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡2,3。SLs在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、研究化療耐藥機制方面起著關(guān)鍵的作用4 ，另外已有研究發(fā)現(xiàn)，帕金森患者體內(nèi)的神經(jīng)酰胺(Cer)和己糖基神經(jīng)酰胺(HexCer)含量偏高5 。 SLs代謝轉(zhuǎn)化快、代謝物種類繁多且功能相似，給單獨研究某一種鞘脂的功能帶來了很大難度。

雖然質(zhì)譜(MS)技術(shù)的進(jìn)步讓研究人員得以進(jìn)行更深入的脂質(zhì)組學(xué)分析，但鑒定和定量分析依然比較困難。脂質(zhì)有大量的同分異構(gòu)和同量異位物質(zhì)。此外，MS譜圖中通常有多種化合物的峰和碎片，要想對特定的分子進(jìn)行明確鑒定和相對定量，不僅難度大，而且極為耗時。這嚴(yán)重阻礙了實驗室之間的脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)傳遞，導(dǎo)致研究人員難以通過多地點研究得出生物學(xué)解釋。本研究使用基于親水作用色譜(HILIC)的方法分離不同類別的脂質(zhì)，然后使用MS進(jìn)行檢測，從而降低了鑒定結(jié)果的不確定性6 。按照圖2. 大多數(shù)研究實驗室的通用脂質(zhì)組學(xué)工作流程，圖中突出顯示了LipidQuan工作流程。類別分離不同的脂質(zhì)還可以減少定量分析所需的穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SIL)標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)而降低成本。本應(yīng)用紀(jì)要介紹了在LipidQuan平臺（圖2）上運行基于HILIC的方法對Cer、HexCer、SPH進(jìn)行的靶向篩查。

 

實驗：樣品向混合的健康人血漿中添加穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SIL)的SLs（氘代CERAMIDE LIPIDOMIX™，Avanti Lipids，美國亞拉巴馬州阿拉巴斯特），制備九個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品用于繪制定量用標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析物的濃度范圍如下：C16神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/16:0) = 2.2-1090 ng/mL、C18神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/18:0)= 1.2-575 ng/mL、C24神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/24:0) =2.6-1315 ng/mL、C24:1神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/24:1) = 1.3-665 ng/mL。另外，通過萃取前加標(biāo)的方式向NIST標(biāo)準(zhǔn)參比物質(zhì)® 1950血漿中（Sigma Aldrich，英國普爾）添加5% SIL，制備6個重復(fù)樣。樣品制備樣品制備方案很簡單，使用預(yù)冷的異丙醇(IPA)沉淀蛋白（1:5，血漿:IPA）即可。將樣品渦旋混合1 min，在-20 °C下放置10 min。接著再將樣品渦旋混合1 min，然后在4 °C下放置2 h，確保蛋白沉淀*。將萃取的樣品在4 °C下離心10 min（大離心力10,300 g），然后將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃樣品瓶，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

實驗 LC條件 LC系統(tǒng)： ACQUITY UPLC I-Class液相色譜系統(tǒng)固定定量環(huán)(FL)或流通針式(FTN) 色譜柱： ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1 × 100 mm, 1.7 µm 柱溫： 45 °C 流速： 0.6 mL/min 流動相A： 95:5乙腈/水 +10 mM醋酸銨流動相B： 50:50乙腈/水 +10 mM醋酸銨梯度： 流動相B在2 min內(nèi)從0.1%升至20.0%，然后在3 min內(nèi)從20%升至80%，隨后重新平衡3 min 運行時間： 8 min 進(jìn)樣體積： 1 µL MS條件 MS系統(tǒng)： Xevo TQ-S micro、Xevo TQ-XS和Xevo TQ-S 電離模式： ESI (+) 毛細(xì)管電壓： 2.8 kV (+) 采集模式： MRM 離子源溫度： 120 °C 脫溶劑氣溫度： 500 °C 錐孔氣流速： 150 L/h 脫溶劑氣流速： 1000 L/h 霧化氣： 7 bar 離子導(dǎo)入裝置偏移1： 3 V 離子導(dǎo)入裝置偏移2： 0.3 V

信息學(xué)軟件創(chuàng)建LipidQuan Quanpedia方法文件（1.4版），其中包含LC條件、MS方法以及相關(guān)的TargetLynx處理方法（包括保留時間和 MRM通道）。使用TargetLynx或Skyline（華盛頓大學(xué)MacCoss 實驗室軟件）處理所得數(shù)據(jù)。

結(jié)果與討論 LipidQuan使用正離子模式MRM對人血漿中的Cer和HexCer類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量，同時還能分析其它脂類，如TG、PC、 SM。在HILIC分離條件下，Cer在溶劑前沿洗脫（大約0.4 min 處），HexCer和SPH類脂質(zhì)洗脫為分離的峰（大約0.8-1.1 min 處），如圖3所示。總共分析了24種Cer、23種HexCer和SPH。得益于該方法的靈敏度，使用50 µL血漿可輕松檢測出人血漿中正常循環(huán)水平的這些脂質(zhì)，其線性動態(tài)范圍覆蓋4個數(shù)量級。此處討論的Cer和HexCer脂質(zhì)通道使用的是脂質(zhì)母離子及其特征長鏈堿基(LCB)子離子(m/z 264)（圖1）。通道列表見表1和表2。使用萃取前加標(biāo)已知濃度SIL標(biāo)準(zhǔn)品的血漿樣品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量分析。采用相同條件制備和分析內(nèi)源性脂質(zhì)的替代標(biāo)準(zhǔn)品，對同類內(nèi)源性脂質(zhì)進(jìn)行了定量分析。使用市售的預(yù)混合SIL 溶液而非每種待測脂質(zhì)的SIL，可以顯著降低大規(guī)模研究的總體成本。SIL標(biāo)準(zhǔn)品C16神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/16:0)、C18神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/18:0)和C24神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/24:0)的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例如圖4所示，可用于定量內(nèi)源性的Cer和HexCer。使用氘代CERAMIDE LIPIDOMIX SIL標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，若典型R2 值＞ 0.95，且與擬合直線的偏差(CV) < 30%，則視為標(biāo)準(zhǔn)曲線可接受。C24:1神經(jīng)酰胺-d7 (d18:1-d7/24:1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線不符合此標(biāo)準(zhǔn)。由于事先已開發(fā)好LipidQuan Quanpedia方法文件，用戶只需下載用于分析Cer和HexCer脂質(zhì)類別的MRM通道和色譜條件即可，無需手動輸入LC-MS方法，因此避免了可能出現(xiàn)的抄錄錯誤