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摘要：在液相色譜方法開發(fā)過程中，經(jīng)常需要改變緩沖液或改性劑濃度來優(yōu)化化合 物的分離。使用配備 Blend Assist 的 Agilent 1290 Infinity 四元泵，可簡化 并加速方法開發(fā)。Blend Assist 是 1290 Infinity 四元泵驅(qū)動程序中配置的軟 件，可通過任意泵控制數(shù)據(jù)系統(tǒng)使用。因此，1290 Infinity 四元泵可以集成 到任意 Agilent 1200 Infinity 液相色譜系統(tǒng)中，提供方法開發(fā)能力。

本技術(shù)概述介紹將 Blend Assist 與 Agilent 1290 Infinity 四元液相色譜系 統(tǒng)結(jié)合，利用三元或四元梯度改變緩沖液/改性劑濃度。通過在配備 Blend Assist 的 1290 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng)上優(yōu)化分離，將開發(fā)的條件 直接應(yīng)用于 Agilent 1290 Infinity 二元液相色譜系統(tǒng)，以證明保留時間和分 離的一致性。

 

前言：在液相色譜方法開發(fā)過程中，經(jīng)常 需要改變緩沖液或改性劑濃度來優(yōu) 化化合物的分離。例如，使用 1290 Infinity 二元液相色譜系統(tǒng)時，必須手 動混合不同的流動相，這一過程既不 方便又耗時，還容易出錯。使用四元 液相色譜系統(tǒng)時，一個或兩個通道中 可能含高濃度的改性劑或緩沖液。通 過改變該通道的流速并采用三元或四 元梯度，可以在不同運行中改變改性 劑/緩沖液濃度以找到條件。

實驗 2：所用的色譜條件 色譜柱： Agilent ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 × 100 mm, 1.8 µm （部件號 959964-902） 流動相： A = 水 B = 乙腈/水：80/20 C = 0.5 mol/L NaH2PO4 (60 g/L) 的水/乙腈 (80/20) 溶液，pH = 4.35，連接至 通道 A 梯度四元： 8 min 內(nèi) B 由 5% 升至 60% 流速： 1.5 mL/min 停止時間： 8.5 min 后運行時間： 3 min 進(jìn)樣量： 1 µL 柱溫： 40 °C DAD： 220/10 nm 參比波長 360/100 nm 流通池：光程 10 mm 峰寬：> 0.013 min (20 Hz)

 

采集和評估軟件 Agilent OpenLAB CDS ChemStation C.01.04 版和 Blend Assist Blend Assist 的參數(shù)設(shè)置和功能 Blend Assist 是 1290 Infinity 四元泵 驅(qū)動程序中配置的軟件，適用于控 制該泵的任何軟件。它為所有 1200 Infinity 液相色譜系統(tǒng)提供了方法 開發(fā)工具。關(guān)于緩沖液/改性劑濃度變 化的所有計算均自動完成。圖 1 顯示 了 Blend Assist 的參數(shù)界面。

 

激活 Blend Assist 后，必須確定應(yīng)連 接在一起的通道。在本例中，將含水 的通道 A 與含 1% TFA 水溶液的通道 C 相連。將含乙腈的通道 B 與含 1% TFA 乙腈溶液的通道 D 相連。通過改變 終 TFA 濃度可以設(shè)置不同方法。圖 1 顯示連接的通道 A 和 C 的終濃度為 0.2%，而對于連接的通道 B 和 D， 終 TFA 濃度為 0.18%?？梢詫舛葐?位設(shè)置為 % 或 mmol/L。在上面的示 例中，使用的是 %。

結(jié)果與討論：實驗 1 改變 TFA 濃度以優(yōu)化曲ma多及其四 種雜質(zhì)的分離

利用 1290 Infinity 四元泵和 Blend Assist，無需針對水相和有機通道混 合不同的 TFA 濃度。

使用四元梯度執(zhí)行下列實驗：

• 將水溶液中 TFA 的濃度從 0.02% 改變?yōu)?0.05%、0.1%、0.2%， 并改變有機相中 TFA 的濃度， 但始終比水相中的濃度低 10%

• 將 Blend Assist 結(jié)果與使用 1290 Infinity 二元液相色譜系統(tǒng) 手動混合流動相獲得的結(jié)果進(jìn) 行比較

提高 TFA 濃度可顯著改善曲ma多的峰 形。在水相中含 0.2% TFA 和有機相 中含 0.18% TFA 的條件下，曲ma多獲 得了峰形。Blend Assist 結(jié)果與 1290 Infinity 二元液相色譜系統(tǒng)采用 的手動混合流動相的結(jié)果相比，二者 高度一致，如圖 4 中的藍(lán)色和紅色譜 圖所示。

此外，曲ma多與雜質(zhì) 2 之間的分離表 明，在水相和有機相中分別使用濃度 為 0.2% 和 0.18% 的 TFA 可獲得分離，如圖 5 所示。

當(dāng)水相中的 TFA 濃度從 0.02% 增加 到 0.2% 時，雜質(zhì) 2 與曲ma多之間的 分離度從 0.48 提高至 2.83。在 1290 Infinity 二元液相色譜系統(tǒng)上獲得的 分離度略高（藍(lán)色譜圖），分離度為 2.92，而在配備 Blend Assist 的 1290 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng)上獲得的 分離度為 2.83（紅色譜圖）。1290 Infinity 二元液相色譜系統(tǒng)上獲得的保 留時間與 1290 Infinity 四元液相色譜系 統(tǒng)上獲得的數(shù)值大偏差為 +0.35%。 圖 6 匯總了雜質(zhì) 2 與曲ma多的分離度 結(jié)果。

實驗 2 改變緩沖液濃度以優(yōu)化普魯卡因 胺、乙酰普魯卡因胺、丙吡胺和奎 尼丁的分離 執(zhí)行下列實驗： • 磷酸鹽緩沖液濃度變化： 10 mmol/L、25 mmol/L、 50 mmol/L • 與使用 1290 Infinity 二元液相 色譜系統(tǒng)的手動混合流動相進(jìn) 行比較

通道 C 根據(jù)流動相組成中所需的緩沖 液濃度以極低流速輸送緩沖溶液。 通道 C 的流速 50 mmol/L 緩沖液：流速 = 130 µL/min 25 mmol/L 緩沖液：流速 = 65 µL/min 10 mmol/L 緩沖液：流速 = 26 µL/min 盡管通道 C 的流速極低，但具有優(yōu)異 的保留時間精密度。對于通道 C，使用 10 mmol/L 緩沖液濃度和 26 µL/min 流 速的保留時間精密度 RSD 介于 0.24% 和 0.03% 之間。

 

結(jié)論：Agilent 1290 Infinity液相色譜 四元泵驅(qū)動程序 中配置的 Blend Assist 軟件有助于在 所有 Agilent 1200 Infinity 液相色譜系 統(tǒng)上進(jìn)行方法開發(fā)?？梢栽跓o需手動 混合不同濃度的情況下改變改性劑/緩 沖液濃度。 在一個示例中，在 1290 Infinity 四元 液相色譜系統(tǒng)上改變 TFA 濃度以改善 主峰峰形和雜質(zhì)分離度。將開發(fā)的方 法轉(zhuǎn)移到 Agilent 1290 Infinity 二元 液相色譜系統(tǒng)，獲得了高度一致的保 留時間和分離度。在另一個示例中， 改變 1290 Infinity 四元液相色譜系 統(tǒng)中的磷酸鹽濃度。另外，如該示例 所示，將所開發(fā)的方法轉(zhuǎn)移至 1290 Infinity 二元液相色譜系統(tǒng)，獲得了高 度一致的保留時間和分離度