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細(xì)胞因子釋放綜合征（Cytokine release syndrome, CRS）一詞最早出現(xiàn)在90年代，當(dāng)時(shí)抗T細(xì)胞抗體OKT3作為免疫抑制劑被引入臨床，用于后的治療?，F(xiàn)在也被稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴（Cytokine storms)。它是由免疫細(xì)胞過度活化引起的一種全身性的炎癥反應(yīng),可由多種因素引發(fā)，例如感染，藥物等。
為什么要進(jìn)行細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)？
TGN1412是以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和白血病為主要目標(biāo)的新型藥物，2006年開展臨床試驗(yàn)，6名健康志愿者在輸注TGN1412后，出現(xiàn)了罕見的病變反應(yīng)，產(chǎn)生了嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放綜合征并伴有多器官功能衰竭。這一事件也使得建立可靠的體內(nèi)動(dòng)物模型和體外細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)來預(yù)測(cè)細(xì)胞因子綜合征的發(fā)生，成為臨床前安全性評(píng)價(jià)的研究熱點(diǎn)。免疫調(diào)節(jié)類的藥物或療法，例如CAR-T，含有CD3靶點(diǎn)的雙抗，屬于細(xì)胞因子釋放綜合癥的高風(fēng)險(xiǎn)類產(chǎn)品。對(duì)于具有潛在風(fēng)險(xiǎn)的藥物，在IND申報(bào)前，根據(jù)CDE在2020年發(fā)布的《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，除了需要在常規(guī)的動(dòng)物體內(nèi)毒性試驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞因子相關(guān)檢測(cè)外，應(yīng)進(jìn)行體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)[9]。
如何設(shè)計(jì)細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)？
由于種屬的差異，動(dòng)物模型可能無法模仿人體免疫激發(fā)的過程，因此當(dāng)體內(nèi)結(jié)果為陰性時(shí)，仍需設(shè)計(jì)合適的體外因子釋放試驗(yàn)以揭示潛在的臨床安全風(fēng)險(xiǎn)。一般采用人全血或人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）評(píng)價(jià)細(xì)胞因子活化和細(xì)胞因子釋放。一般來說，相比于全血，PBMC對(duì)免疫調(diào)節(jié)類的產(chǎn)品更為敏感，更易得到陽性的結(jié)果。但是PBMC并不能很好的模擬真實(shí)的體內(nèi)環(huán)境，也可以考慮采用稀釋后的全血，例如采用20%（v/v）或10%（v/v）等體積比的全血。一般而言，需要使用至少3名健康受試者的全血或PBMC來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若采用全血，不同受試者之間的變異程度可能更大，也可以考慮增加受試者的數(shù)量。一些靶點(diǎn)只會(huì)在特定的疾病群體中高度表達(dá)，在這種情況下，也可以使用特定疾病群體的全血或者PBMC來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
圖1. TGN1412體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)的6種模型[1]
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，需要考慮固相法或液相法兩種孵育體系，以盡可能模擬體內(nèi)抗體呈遞給T細(xì)胞的方式。NIBSC設(shè)計(jì)了6種基于PBMC的TGN1412的細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚1]。方案1和2均為液相法，不同的是方案2中還引入了Anti-Fc抗體;方案3和方案4均為固相法，分別用濕法（Wet-coated）和干法(Air-dried)將TGN1412包被到細(xì)胞培養(yǎng)板上。方案5中將抗Fc的抗體包被到孔板后再加入TGN1412，整合了方案3和4中的方法；方案6中則引入了人內(nèi)皮細(xì)胞，以模擬人體內(nèi)的TGN1412和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。方案1和2和TGN1412臨床前安全性評(píng)價(jià)中使用的方法類似，不能刺激細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子。當(dāng)方案3不能刺激細(xì)胞釋放細(xì)胞因子時(shí)，可以考慮方案4,5和6，這些方案中至少有一種能將TGN1412呈遞給T細(xì)胞以提供有效的體外刺激。鑒于藥物誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放的機(jī)理和靶點(diǎn)的復(fù)雜性，還需具體情況具體分析，選擇最合適的體外刺激模型。
檢測(cè)哪些細(xì)胞因子？
CRS的病理生理機(jī)制尚不清楚。CRS通常是由于藥物和細(xì)胞受體結(jié)合引起的靶效應(yīng)，其抗原隨后激活旁觀者免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞。CRS可以通過連續(xù)釋放干擾素γ (IFN-γ)或腫瘤壞死因子α (TNF-α)等細(xì)胞因子直接裂解靶細(xì)胞或通過治療性刺激激活T細(xì)胞并隨后釋放細(xì)胞因子來誘導(dǎo)。由于先天免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的激活，這些細(xì)胞因子觸發(fā)連鎖反應(yīng)，進(jìn)一步釋放細(xì)胞因子。IL-6，IL-10和IFN-γ是發(fā)生CRS的患者血清中持續(xù)升高的主要因子。CRS是由活化的T細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞自身大量釋放IFN-γ觸發(fā)的。IFN-γ會(huì)引起發(fā)燒、寒戰(zhàn)、頭痛、頭暈和疲勞，并誘導(dǎo)其他免疫細(xì)胞的活化，尤其是巨噬細(xì)胞[2]?；罨木奘杉?xì)胞會(huì)進(jìn)一步分泌大量的IL-6、TNF-α和IL-10。TNF-α?xí)鸷虸FN-γ類似的癥狀。除了上述的因子外，多項(xiàng)研究表明[3][7][8]，細(xì)胞活化也會(huì)引起IL-2的大量釋放，高濃度的IL-2和IFN-γ已被認(rèn)為是類似于TGN1412反應(yīng)的標(biāo)志[4]。IL-6則會(huì)引起嚴(yán)重的CRS特征性癥狀，如即血管滲漏，激活補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)彌散性血管內(nèi)凝血等[2]。細(xì)胞因子的檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)與受試藥物臨床安全性考慮密切相關(guān)，一般情況下，觀察指標(biāo)包括但不限于IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α。除了上述的因子，一些藥物可能也會(huì)引起其他相關(guān)的細(xì)胞因子的釋放，例如IL-1b, IL-5, IL-8,IL-12,和IL-17等。因此細(xì)胞因子的選擇需要根據(jù)藥物靶點(diǎn)、靶向細(xì)胞群以及藥物的作用機(jī)制等進(jìn)行特異性的調(diào)整。
圖2.細(xì)胞因子綜合征的誘因和發(fā)生機(jī)制[2]
如何選擇陽性和陰性質(zhì)控？
由于細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)的設(shè)計(jì)多樣，不同的藥物在不同的體外模型中會(huì)有不同的結(jié)果，因此選擇合適的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。陰性對(duì)照有多種選擇，例如PBS，陰性對(duì)照單抗（例如Avastin），Isotype，或者用于稀釋全血的細(xì)胞培養(yǎng)基。在細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，陰性對(duì)照可能還需要包括在沒有藥物刺激的情況下PBMC和靶細(xì)胞共培養(yǎng)以及在有藥物的情況下PBMC和非靶細(xì)胞的共培養(yǎng)。陽性對(duì)照一般可以選擇OKT3（anti-CD3）,TGN1412(anti-CD28)，LPS，PHA，PMA和離子霉素等。除此之外，也可以根據(jù)體外模型增加相應(yīng)的對(duì)照樣品。
