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免疫療法已被證明是一種很有前途的治療方法。但由于免疫相關(guān)的潛在的嚴(yán)重不良反應(yīng)，使許多研究人員依賴小鼠模型來獲得對于研究的治療產(chǎn)品或療法進行更深入的了解。從早期研發(fā)到臨床的整個過程中，IsoPlexis的單細(xì)胞解決方案一直在這方面幫助研究人員，通過體外實驗獲得與體內(nèi)活性相關(guān)指標(biāo)。

通過檢測每個細(xì)胞同時分泌多個細(xì)胞因子的能力，即細(xì)胞的多功能性，檢測*的細(xì)胞亞群進而建立這種聯(lián)系。對于單細(xì)胞多功能檢測，允許研究人員發(fā)現(xiàn)臨床前發(fā)展的新機制，并加速他們的研究。相比于傳統(tǒng)的動物模型實驗有著很大的優(yōu)勢。

IsoPlexis單細(xì)胞蛋白組技術(shù)使用了一種綜合的評價標(biāo)尺——細(xì)胞多功能指數(shù)(PSI)，對細(xì)胞的功能進行表征。PSI作為單細(xì)胞功能生物標(biāo)志物的新標(biāo)準(zhǔn)，可以幫助研究人員加速他們的免疫治療項目。

這個新解決方案運行在IsoLight、IsoSpark和IsoSparkDuo系統(tǒng)上，與之配套的是通用的IsoCode芯片，一張芯片可分離500-1500個單細(xì)胞，進行單細(xì)胞培養(yǎng)，檢測細(xì)胞的分泌蛋白。*的條形碼技術(shù)可同時檢測一個細(xì)胞分泌的的多達(dá)32個細(xì)胞因子。這使得研究人員能夠深入研究細(xì)胞的功能。

IsoPlexis新的解決方案加快體內(nèi)實驗及研發(fā)進程

使用小鼠模型進行體內(nèi)研究可能需要幾周的時間，而使用IsoPlexis平臺的研究人員可以更快地得到結(jié)果。我們來看一下兩個相關(guān)的應(yīng)用案例。

多功能GPC3CAR-T治療鼠原位肝癌

Glypican3(GPC3)是Wnt依賴性細(xì)胞增殖的抗原，在肝癌(HCC)中高表達(dá)。2020年在Gastroenterology(IF= 22.682)文章中報道，研究者利用基于人源化YP7(hYP7)和HN3抗體制備CAR-T細(xì)胞，靶向GPC3，并評價其功能。

多功能T細(xì)胞是T細(xì)胞的一個亞群，能夠在單細(xì)胞水平上共同產(chǎn)生兩個或多個細(xì)胞因子/趨化因子，近有報道稱它們在臨床環(huán)境中與持久免疫反應(yīng)相關(guān)。研究者使用IsoPlexis的單細(xì)胞蛋白組技術(shù)對制備的CAR-T進行了功能評價。使用能夠同時檢測32中關(guān)鍵的T細(xì)胞免疫因子的芯片對CAR-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進行檢測，比較了CAR（HN3）T細(xì)胞或CAR(hYP7)T細(xì)胞的多功能性，與Mock對照組相比，CAR(hYP7)T細(xì)胞能夠分泌多種因子的細(xì)胞比例更高，表現(xiàn)出更強的多功能性，提示可能有著更強的功能、更好的治療效果（圖1）。

圖1：Heatmap圖顯示hYP7CAR-T細(xì)胞中表現(xiàn)出更強的多功能性

在之后的小鼠模型實驗中，研究者在NOD/SCID/IL-2Rgcnull(NSG)小鼠腹腔注射表達(dá)熒光素酶的Hep3B或HepG2細(xì)胞，在腫瘤形成后，小鼠注射生理鹽水或未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞（Mock），或不同劑量的CAR（HN3）T細(xì)胞或CAR(HYP7)T細(xì)胞。結(jié)果顯示，在CAR（HN3）T細(xì)胞處理的小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤生長抑制。接受20M CAR (hYP7) T細(xì)胞治療的小鼠在第70天均存活，沒有復(fù)發(fā)。接受hYP7CAR-T細(xì)胞注射的小鼠的治療效果更好（圖2）。

圖2：對照與多種劑量不同CAR-T組效果對比

基于APRIL三聚體（TriPRIL）設(shè)計的CAR-T細(xì)胞靶向治療多發(fā)性骨髓瘤

2019年BloodAdvances雜志上題為《RationalDesign of a Trimeric APRIL-Based CAR Binding Domain Enables EfficientTargeting of MultipleMyeloma》的文章中，研究者發(fā)表了基于APRIL三聚體的CAR結(jié)合域的合理設(shè)計靶向多發(fā)性骨髓瘤的研究進展。

在多發(fā)性骨髓瘤的治療和研究中，CAR-T細(xì)胞治療提供了新的治療路徑，其中靶向B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)的CAR-T細(xì)胞治療是迄今為止有希望的治療方式，但其療效仍然存在挑戰(zhàn)，因為在單特異性抗BCMACAR-T細(xì)胞治療的選擇壓力下，會出現(xiàn)BCMA抗原逃逸變異，從而導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，因此仍需要不斷改進CAR-T細(xì)胞以改善多發(fā)性骨髓瘤的療效。

在這里研究者證實了基于APRIL三聚體的新型CAR（圖3）能有效地靶向BCMA陽性和BCMA陰性的多發(fā)性骨髓瘤。雙特異性、基于三聚體APRIL的CAR是一種很有前途的治療多發(fā)性骨髓瘤的方法，有可能預(yù)防和治療BCMA抗原逃逸。

圖3：APRIL和TriPRIL CARs設(shè)計

研究者將對照T細(xì)胞（UTD）、BCMA、APRIL和TriPRILCAR-T同表達(dá)BCMA和TACI的靶細(xì)胞一起培養(yǎng)，靶細(xì)胞會刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，使用IsoPlexis檢測32種細(xì)胞分泌蛋白的條形碼芯片捕獲T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子。相對于其它實驗組，TriPRILCAR-T組細(xì)胞中的多功能細(xì)胞的比例顯著提高（圖4），單細(xì)胞分析表明，CD4+和CD8+T細(xì)胞主要分泌效應(yīng)型細(xì)胞因子，在不同的CAR-T中細(xì)胞因子分泌譜相似，但分泌頻率有顯著差異（圖5）。

圖4：單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)檢測不同CAR-T的多功能細(xì)胞比例

圖5：單細(xì)胞水平表征分泌因子圖譜

動物實驗方面，在BCMA陽性小鼠腫瘤模型中，BCAM和TriPRILCAR-T的治療效果都是很好的；在BCMA陰性小鼠腫瘤模型中，因為腫瘤抗原逃逸，只有TriPRILCAR-T取得了很好的治療效果（圖6）。

圖6：小鼠實驗結(jié)果，TriPRILCAR-T有效靶向BAMA陽性和陰性的多發(fā)性骨髓瘤。

SchmidtsA , Ormhj M , Choi B D , et al. Rational design of a trimericAPRIL-based CAR-binding domain enables efficient targeting ofmultiple myeloma - ScienceDirect[J]. Blood Advances, 2019.

總結(jié)：

動物實驗動輒需要數(shù)個星期，甚至如個實驗，需要持續(xù)70天；單細(xì)胞蛋白組技術(shù)在一周內(nèi)即可完成細(xì)胞功能的表征。應(yīng)用于體內(nèi)療效相關(guān)性分析時，單細(xì)胞蛋白組技術(shù)體現(xiàn)了以下特點：

• 其結(jié)果與動物實驗是可比的；

• 可以很好的優(yōu)化研究和藥物研發(fā)流程；

• 夠加快體內(nèi)實驗的進程，節(jié)省寶貴的時間；

• 找到關(guān)鍵分泌蛋白，指導(dǎo)后續(xù)研究。