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            實現(xiàn)免疫細胞高效基因轉(zhuǎn)導的三個步驟
            2021-10-28　　閱讀(488)
            

            
							
				
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            圖1：免疫系統(tǒng)細胞分化圖

            Boosting the Immune System–
            Steps to Take for Successful Substrate Delivery
            嵌合抗原受體表達細胞的產(chǎn)生和基于CRISPR/Cas9的基因組編輯等新技術(shù)的建立，為改善或增強免疫應(yīng)答提供了簡便易行的方案。然而，將底物輸送到我們的目的細胞中是需要的-不僅要注重高轉(zhuǎn)染效率，而且要注重細胞活性、功能性的保存以及患者的健康和安全。此外，傳遞方法在底物方面應(yīng)該是靈活的，因為編輯細胞基因組的研究人員不僅依賴于質(zhì)粒DNA的成功轉(zhuǎn)染，還依賴于RNA和/或蛋白質(zhì)的成功轉(zhuǎn)染[1]。
            到目前為止，原代免疫細胞的轉(zhuǎn)染是具有挑戰(zhàn)性的。特別是大家感興趣的細胞類型，如T淋巴細胞、自然殺傷細胞和B細胞，用經(jīng)典的基于試劑的方法很難轉(zhuǎn)染[2]。使用轉(zhuǎn)染試劑的主要問題是轉(zhuǎn)染效率低、細胞毒性和免疫原性。后者在免疫治療方面是不利的，因為細胞應(yīng)該維持它們在免疫系統(tǒng)中的功能，而不是被轉(zhuǎn)染方式預先激活。

            實現(xiàn)合理轉(zhuǎn)染效率的替代方法是病毒轉(zhuǎn)導，但病毒生產(chǎn)耗時且成本高，另一種方案是改進的電穿孔技術(shù)，如NucleofectorTM技術(shù)，作為一種物理的方法，它只需要很低的生物安全預防措施(表1)。




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            表1：不同底物輸送給原代免疫細胞的優(yōu)缺點綜述

            實現(xiàn)免疫細胞
            高效基因轉(zhuǎn)導的三個步驟
            步驟1-選擇合適的轉(zhuǎn)染方法
            通過病毒轉(zhuǎn)導，可以將感興趣的基因整合到宿主基因組中。常用的是慢病毒載體，慢病毒載體尚不能將目的基因插入到特定位點而是隨機插入。

            一種將底物遞送到人體免疫細胞的便捷技術(shù)是NucleofectorTM技術(shù)，這是一種改進的電穿孔技術(shù)。的NucleofectorTM解決方案與針對特定細胞類型優(yōu)化的電轉(zhuǎn)參數(shù)相結(jié)合，使研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率和良好的存活率。底物直接輸送到細胞質(zhì)和細胞核。小化的免疫原性保留了免疫細胞的功能(圖2)。

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            圖2：Nucleofection后的細胞功能。條形圖顯示了小鼠樹突狀細胞、人類巨噬細胞和人類T細胞在Nucleofection后的相對功能(樣本)。功能以與未轉(zhuǎn)染對照(對照)相關(guān)的百分比表示。用小鼠樹突狀細胞的IL-6特異性ELISA、人巨噬細胞的TNF-a特異性ELISA、刺激的人T細胞的IFN-g特異性ELISA和CD25特異性抗體(靜息狀態(tài)和刺激狀態(tài))流式細胞儀進行功能分析。實驗是在標準的NucleofectorTM設(shè)備(小鼠樹突狀細胞)或96孔ShuttleTM系統(tǒng)(人巨噬細胞和人T細胞)上進行的。[3]
            NucleofectorTM技術(shù)不僅了效率和可行性?？紤]到表達CAR的T細胞[4]和NK細胞[5]以及基因組編輯[6]，不同底物的共轉(zhuǎn)染也是可以簡單的實現(xiàn)-在大小和底物類型上具有很大的靈活性，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)。

            通過使用4D-NucleofectorTM技術(shù)，實現(xiàn)封閉和可擴展的轉(zhuǎn)染應(yīng)用。它可以很容易地從用于基礎(chǔ)研究或篩選目的的20-100ul小規(guī)模體系到高達20ml的后續(xù)應(yīng)用，例如用于細胞治療的體外修飾。


            步驟2-讓你的免疫細胞循規(guī)蹈矩
            不管底物遞送的方法是什么，免疫細胞在轉(zhuǎn)染前的狀態(tài)決定了之后細胞的活性和功能。細胞對轉(zhuǎn)染過程的反應(yīng)有多強烈或敏感，一方面取決于分離過程，另一方面也存在供體特性的問題。

            能夠獲得血液或骨髓樣本以自我分離免疫細胞的研究人員，應(yīng)確保遵守既定的分離、刺激免疫細胞的標準操作程序。嚴格按照說明操作將產(chǎn)生可比較和可重現(xiàn)的結(jié)果。

            如果無法獲得這種來源，研究人員就會利用商業(yè)上可獲得的造血細胞和免疫細胞進行研究。這有利于在質(zhì)量控制和優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)方面的工作。

            然而，無論細胞的來源是什么，原代細胞都是來自單個有機體的細胞。捐贈者特定的差異是不可避免的，并將導致結(jié)果差異[7]。


            步驟3-準備好穩(wěn)定的底物遞送
            對于病毒轉(zhuǎn)導來說，病毒顆粒的制備是復雜的，而用于改良電穿孔的底物選擇則更加多樣化。

            為了確保的條件，底物應(yīng)該是高質(zhì)量的。當我們選擇質(zhì)粒DNA進行基因遞送時，有許多需要考慮的方面，關(guān)于載體DNA的信息可以在Lonza Important Vector Factors for Gene Expression Technical Reference Guide中找到。

            底物的大小和濃度是這個游戲中的額外玩家。底物大小本身通常不是影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素，但當質(zhì)粒大小超過約15kb時，效率會有所下降。因此，在轉(zhuǎn)染較大的質(zhì)粒時更要考慮實驗所需的DNA量和質(zhì)粒的完整性。增加每個反應(yīng)的DNA含量通常會提高轉(zhuǎn)染效率，但由于高濃度的DNA可能會對細胞產(chǎn)生毒性，細胞存活率可能會降低。對于Nucleofection實驗，的底物濃度通常在2-5ug/100ul(DNA)、2 nM-2uM(siRNA)和10-20ug/100ul(mRNA)之間。


            關(guān)于的Nucleofection條件，請在圖一找到找到免疫系統(tǒng)細胞分化的圖表(圖1)。下面的表2總結(jié)了大多數(shù)這些細胞的轉(zhuǎn)染條件以及4D-NucleofectorTM系統(tǒng)的參考文獻。




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                                                 表2：人類原代免疫細胞Nucleofection條件、結(jié)果和參考文                                           獻(OP：optimized protocol可用的優(yōu)化方案，IHD：in-house data基于內(nèi)部數(shù)據(jù))

            龍沙于支持您對免疫系統(tǒng)的研究，這就是我們提供 NucleofectorTM 技術(shù)和相應(yīng)的 NucleofectorTM 試劑盒以高效轉(zhuǎn)染免疫細胞的原因。此外，我們還提供來自各種不同供體的造血和免疫細胞。



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            第二代NucleofectorTM 裝置
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            4D-NucleofectorTM X Unit ——適用于 100 µL 比色皿或 20 µL 16 孔試管中的各種細胞數(shù)量
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            4D-NucleofectorTM Y Unit ——用于轉(zhuǎn)染 24 孔培養(yǎng)板的貼壁細胞
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            4D-NucleofectorTM LV Unit ——用于封閉、可擴展的大容量轉(zhuǎn)染多達1x109 個細胞
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            4D-NucleofectorTM 96 孔裝置——一次同時轉(zhuǎn)染多達96 個樣品


            selected   References
            1 ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering
            2 Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques
            3 Nucleofection – Combining High Transfection Performance with Superior Preservation of Functionality
            4 A new approach to gene therapy using Sleeping Beauty to genetically modify clinical-grade T cells to target CD19
            5 Genetic manipulation of NK cells for cancer immunotherapy: Techniques and clinical implications
            6 A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors
            7 Human immune system variation
            8 Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells
            9 Alterations in Cholesterol Metabolism Restrict HIV-1 Trans Infection in Nonprogressors
            10 Altered expression of miR-181a and miR-146a does not change the expression of surface NCRs in human NK cells
            11 Hyperactive piggyBac Gene Transfer in Human Cells and In Vivo
            12 Characterization of Programmed Death-1 Homologue-1 (PD-1H) Expression and Function in normal and HIV Infected Individuals
            13 IL-27 inhibits HIV-1 infection in human macrophages by down-regulating host factor SPTBN1 during monocyte to macrophage differentiation
            14 Generation of multivirus-specific T cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant



            
      
            
      
      
            
    
            
    
            
  
            

            
		 







  
    
    				
			

		
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

    

     
     
     
	 



	
	
	


            
	
            
		
            
			
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