節(jié) 免疫組化操作步驟及抗原修復（供參考）

一、免疫組化操作步驟
（一）、儀器設(shè)備
1、 18 cm 不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐
2、 水浴鍋
（二）、試 劑
1、 PBS 緩沖液（pH7.2―7.4） 吉試劑
2、 0.01mol/L 檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH6.0,1000 ml）
3、 3% 甲醇―H2O2 溶液：用 30% H2O2 和 80% 甲醇溶液配制
4、 風裱劑：
a. 甘油和 0.5 mmol/L 碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合
b. 油和 TBS（PBS）配制
5、 TBS/PBS pH9.0–9.5，適用于熒光纖維鏡標本；pH7.0-7.4 適合光學纖維標本
（三）、操作流程
1、 脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置 60 分鐘或 60℃ 恒溫箱中烘烤 20 分鐘
a. 組織芯片置于二甲苯中浸泡 10 分鐘，更換二甲苯后在浸泡 10 分鐘
b. 無水乙醇中浸泡五分鐘
c. 95% 乙醇中浸泡五分鐘
d. 75% 乙醇中浸泡五分鐘
2、 抗原修復：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片
二、抗原修復（免疫組化石蠟切片）
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復。
福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結(jié)構(gòu)，蛋白多肽發(fā)生交聯(lián)，導致部分抗原表位封閉，結(jié)合位點減少，所以需要抗原修復，以暴露原來的抗原表位，達到充分顯露抗原，以不出現(xiàn)明顯脫片現(xiàn)象為佳。
抗原修復的幾種常用方法（供參考）
1、 微波爐加熱：
在微波爐里加熱 0.01 枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔 5-10 分鐘，反復 1-2 次。根據(jù)玻片情況可參考采用微波加熱「3-5-3 法」3 分鐘溫火沸騰后靜止 5 分鐘，再溫火沸騰 3 分鐘即可。
適用的抗原：來源于人、大鼠、小鼠的組織標本；來源于其他動物種屬的組織標本。
2、 沸熱修復：
電爐或水浴鍋加熱 0.01M 枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0） 95℃ 左右，放入組織芯片加熱 10-15 分鐘。
3、 高壓熱修復：
在沸水中加入 EDTA（pH8.0）或 0.01m 枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）. 蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10 分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。（骨及軟骨組織的標本選擇較溫和的微波加熱修復）。
4、 酶消化方法：
常用 0.1% 胰蛋白酶和 0.4% 胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱 37℃，消化時間約為 5-30 分鐘。
適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN. 等。
三、石蠟切片免疫組化染色步驟
1、三步法（以 SP 試劑盒為例）
 石蠟切片脫蠟水
 蒸餾水沖洗，PBS 浸泡 5 分鐘，如果采用抗原修復，可在此步后進行
- 3% H2O2 室溫孵育 5~10 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS 沖洗，2 分鐘×3 次
- 5~10% 正常山羊血清封閉，室溫孵育 10 分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃ 孵育 1~2 小時或 4℃ 過夜
-PBS 沖洗，2 分鐘×3 次
滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS 稀釋），37℃ 孵育 10~30 分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃ 或室溫孵育 10~20 分鐘
 PBS 沖洗，2 分鐘×3 次
滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS 稀釋），37℃ 孵育 10~30 分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃ 或室溫孵育 10~20 分鐘
 PBS 沖洗，2 分鐘×3 次
顯色劑顯色（DAB 或 AEC）--（DA1010 DAB 顯色試劑盒（20×））吉試劑
自來水充分沖洗，復染，脫水透明、封片
如果必要，可選用 avdin 封閉內(nèi)源性生物素
2.SABC 法
脫蠟、水化
PBS 洗 2 次各 5 分鐘
用蒸餾水或 PBS 配制新鮮的 3% H2O2 ，室溫封閉 5-10 分鐘，用蒸餾水洗 3 次
抗原修復
PBS 洗 5 分鐘
滴加正常山羊血清封閉液，室溫 20 分鐘，甩去多余液體
滴加Ι抗 50ul, 室溫靜置 1 小時或 4℃ 過夜或 37℃1 小時
PBS 洗 3 次各 2 分鐘
滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20 分鐘
PBS 洗 3 次各 2 分鐘
滴加試劑 SABC 20℃-30℃ 20 分鐘
PBS 洗 4 次各 5 分鐘
DAB 顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色
脫水、透明、封片、鏡檢
四、冰凍切片的免疫組化染色步驟
速凍組織
冰凍切片 4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內(nèi)，或進行短暫預固定后儲存于-20℃ 冰箱
室溫放置 30 分鐘后，入 4℃ 丙酮固定 10 分鐘，也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式
PBS 沖洗，5 分鐘×3 次
用 3% 過氧化氫孵育 5~10 分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性
PBS 沖洗，5 分鐘×3 次
下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）
第二節(jié) 免疫組化抗原熱修復的技術(shù)要點（供參考）
一、抗原熱修復溫度和時間的關(guān)系
我們?nèi)粘９ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過程如下：
步：基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物；
第二步：基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋。
上述反應(yīng)的結(jié)果導致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復的兩個關(guān)鍵的因素是溫度和時間，有人將這兩種因素對抗原修復的影響總結(jié)為下面的公式： 抗原熱修復的有效性=加熱溫度（T）× 加熱時間（t）。
也就是說當我們修復時的溫度越低則需要修復的時間就越長；反過來當修復溫度增高時修復的時間可以適當?shù)乜s短，才能使抗原決定簇*暴露，這種反比的關(guān)系從 MBI 單克隆抗體的實驗結(jié)果「表 1」中也可以清楚地看出。

如果修復強度不夠，免疫組織化學染色所顯示的只能是修復后暴露的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對免疫組化進行定量的需要。這就給我們診斷中定量指標的應(yīng)用帶來困難，例如用來測定耐藥的指標。
二、組織固定時間和所需的抗原熱修復的關(guān)系
大量的實驗表明，固定時間越長的標本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復強度也就越強。有意思的是隨著固定時間的延長，組織中蛋白對溫度的耐受也相應(yīng)增高，這可能就是我們對固定時間長的標本加大修復強度的理論基礎(chǔ)。
這就提醒我們在做回顧性的研究時一定要注意所使用的修復條件，它與新鮮標本的修復條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長修復的時間或提高修復所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。
三、不同 pH 值抗原修復液對染色結(jié)果的影響
抗原熱修復中所使用的修復液 pH 值也會對染色結(jié)果產(chǎn)生相當大的影響。
pH 值對染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況：
A. 穩(wěn)定型，pH 值對染色結(jié)果影響不大，如 PCNA、AE1、EMA、CD20 等；
B.V 型，高 pH 值和低 pH 值染色較好，而 pH 值 4-5 染色結(jié)果較差，如 ER、Ki-67 等；
C. 上升型，隨著 pH 值的增加，染色結(jié)果逐漸增強，如 HMB45 等；
D. 下降型，隨著 pH 值的增加染色結(jié)果逐漸減弱，當然這種類型的抗體只是個別的現(xiàn)象，如 MOC31。
一個有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高 pH 值都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復液為高 pH 值得修復液，如 1 mM EDTA, pH8.0 或 pH9.0 等。但是由于傳統(tǒng)習慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實驗室都在使用 pH6.0 的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高 pH 值得修復液來代替目前廣為使用的 pH6.0 枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出 pH8.0 和 pH9.0 的新型抗原修復液。經(jīng)驗證，絕大多數(shù)的抗體使用 pH9.0 得修復液效果都要優(yōu)于 pH6.0 的枸櫞酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高 pH 值的抗原修復液是今后的必然趨勢。