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脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
閱讀：483 發(fā)布時(shí)間：2019-3-19| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 30.2KB |
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實(shí)驗(yàn)材料 靶細(xì)胞DNA
試劑、試劑盒 陽(yáng)離子脂質(zhì)D-PBSA緩沖鹽溶液NaCl 0.25%胰蛋白酶
儀器、耗材 細(xì)胞培養(yǎng)基還原的血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基多孔培養(yǎng)板
實(shí)驗(yàn)步驟
A . 貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
1. 將 1.3X105 個(gè)細(xì)胞/孔接種到 6 孔培養(yǎng)板，加 3 ml 培養(yǎng)基。
2. 于 37°C 的 CO2 孵箱培養(yǎng)至 50%~90% 匯合。這一過程至少需 16 h , 通常為 18~24 h。
3. 轉(zhuǎn)染前，在無菌試管中制備 DNA 及脂質(zhì)體溶液：
(a) 對(duì)于 DNA 溶液，將 1~2 μg DNA 在 0.5 ml 的還原血清中稀釋
(b) 對(duì)于脂質(zhì)體溶液，取 2~25 μl 的陽(yáng)離子脂質(zhì)試劑稀釋到 25 μl， 再加入 0.5 ml 的無血清培養(yǎng)基（無血清或抗生素的 DMEM）。
陽(yáng)離子脂質(zhì)
Lipofectamine: 多價(jià)陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DOSPA 與中性脂質(zhì)體 DOPE 3 : 1 (w /w )混合物（Invitrogen )
Lipofectin: 即陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DOTMA (N -[l -(2，3 dioleyloxy)-propyl]-N，N ,N -trimethylamonium chloride) 與中性脂質(zhì)體 DOPE 1 : 1 (w /w ) 混合物（Invitrogen)
LipofectACE : 為合成陽(yáng)離子 DDAB 脂質(zhì)體與神經(jīng)脂質(zhì) DOPE 體1 : 2.5 (w /w )混合物（Invitrogen )
(c) 將兩溶液混合，小心混勻，然后室溫下靜置 15~45 min，以使 DNA -脂質(zhì)體形成混合物。
4. 用 2 ml 無血清培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞。
5. 將 DNA-脂質(zhì)體混合物鋪布在培養(yǎng)細(xì)胞之上，轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)不含抗生素。
6. 將轉(zhuǎn)染細(xì)胞于 37℃ 的 CO2 培養(yǎng)箱孵育 2~24 h ，一般 5~6 h 即可。
7. 孵育后，棄除轉(zhuǎn)染混合物，改加 3 ml *培養(yǎng)基。
8. 18~24 h 后換液（仍為*培養(yǎng)基）。
9. 依實(shí)驗(yàn)要求，吸取培養(yǎng)基或收獲細(xì)胞，測(cè)定基因瞬時(shí)表達(dá)的活性（見方案 27. 14 和方案 27. 15)。
B. 懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
1. 在無菌試管中制備轉(zhuǎn)染的混合物，如下所示：
(a) 將 2.5 μg DNA 以 0.5 ml 的還原血清培養(yǎng)基稀釋。
(b) 將 2~20 μl 陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑以 0.5 ml 無血清培養(yǎng)基稀釋。
(c) 混合兩種溶液，輕輕混勻，然后于室溫下孵育 15~45 min，使 DNA-脂質(zhì)體混合物形成。
2. 將 1X106~2X106 個(gè)細(xì)胞懸浮液離心，棄去培養(yǎng)基。
3. 在轉(zhuǎn)染混合液中將細(xì)胞再制成懸浮液，將其轉(zhuǎn)移至一個(gè) 35 mm 培養(yǎng)皿。
4. 在 CO2 培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞 4~6 h。
5. 向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入 0.5 ml 含 30 % 血清的培養(yǎng)基（懸浮細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)試劑的毒性極為敏感，為避免細(xì)胞破壞，應(yīng)加大量的血清保護(hù)細(xì)胞）
6. 在 CO2 培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
7. 次日，向每個(gè)培養(yǎng)販中加入 2 ml *培養(yǎng)基，在 CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
8. 在轉(zhuǎn)染后 24~72 h ，依實(shí)驗(yàn)要求，吸取培養(yǎng)基或收獲細(xì)胞，測(cè)定基因瞬時(shí)表達(dá)的活性（見方案 27. 14 和方案 27. 15)。