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大鼠MSCs的獲得和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)
閱讀：252 發(fā)布時(shí)間：2018-12-14| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 250.8KB |
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大鼠MSCs的培養(yǎng)基本上與人MSCs的培養(yǎng)方法相同，只有少許差異。人和大鼠MSCs擴(kuò)增方案的主要區(qū)別是，大鼠MSCs在單層細(xì)胞40%?50%匯合時(shí)傳代，而人的細(xì)胞可以在密度達(dá)到50%?60%匯合后傳代。這是因?yàn)?，培養(yǎng)中過度的細(xì)胞間接觸會(huì)使大鼠MSCs的增殖和多向分化潛能顯著下降。收集大鼠MSCs時(shí)，骨髓細(xì)胞應(yīng)取自新處死動(dòng)物的長(zhǎng)骨。用實(shí)驗(yàn)方法原理
實(shí)驗(yàn)材料 大鼠骨髓
試劑、試劑盒 滅菌CCM含0.2μg ml兩性霉素B(兩性霉素B洗劑）紗布含100U ml青霉素100μg ml鏈霉素和0.2μg ml兩性霉素B的PBSA無鎂和鈣的Hank’s平衡鹽溶液（HBSS)
儀器、耗材 塑料Petri培養(yǎng)皿 15 cm直徑裝有#10和#15刀片的解剖刀1和2英尺刀刃的手術(shù)剪鑷子止血鉗15 cm刀刃的咬骨鉗帶Luer接頭的注射器20ml皮下注射針 23號(hào)和18號(hào)微量離心管1.5ml和0.5ml聚丙烯離心管CO2嚙齒動(dòng)物小室
實(shí)驗(yàn)步驟
(a)CO2窒息處死動(dòng)物，切勿使用藥物。
(b)用酒精擦拭后肢，在不破壞股骨的情況下解剖后肢。將股骨從肢體中分出來。
(C)切除股骨上的肌肉和肌腱。用無菌紗布擦拭除去骨上的剩余組織。
(d)用酒精擦拭已清理干凈的骨，將其放人50 ml塑料管中。
(e)用含抗真菌藥物的冰浴CCM浸沒骨，直到骨髓提取準(zhǔn)備完畢。從分離骨到骨髓提取的時(shí)間應(yīng)盡量縮短。
(f)裝有股骨的離心管移至微生物安全廚中，將骨放人15 cm petri培養(yǎng)皿中。
(g)按如下步驟提取骨髓：用咬骨鉗剪掉骨的兩端，暴露內(nèi)部骨髓。裝有23G針頭的注射器中吸人5ml含抗真菌藥物的CCM，向50ml離心管中沖洗每根股骨。吸取沖洗后的CCM，反復(fù)沖洗股骨3次，將其轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中。1000g離心，用1ml含抗真菌藥物的CCM重懸骨髓沉淀。在15 ml離心管中將1 ml骨髓細(xì)胞懸液加入到4 ml含抗生素和抗真菌藥物的新鮮PBSA中。每根股骨所得的5ml細(xì)胞懸液可混合于同一個(gè)離心管中。
(h)在l0℃1000g離心骨髓細(xì)胞10 min,用10ml含抗生素和抗真菌藥物的PBSA洗滌細(xì)胞3次。
(i)后，用5 mlCCM重懸骨髓細(xì)胞，置于冰上。