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免疫熒光技術(shù)
閱讀：185 發(fā)布時(shí)間：2018-9-7| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 22KB |
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直接免疫熒光法測(cè)抗原
基本原理
將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
試劑與儀器
l 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
l 熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋
l 緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
l 搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
l 有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）
l 熒光顯微鏡
l 玻片架
l 濾紙
l 37℃溫箱等。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。
2. 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其*覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間（參考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。
4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：
（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對(duì)照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。
注意事項(xiàng)
1. 對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。
2. 染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長(zhǎng)染色時(shí)間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。
3. 為了保證熒光染色的正確性，試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
（1） 標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
（2） 特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
（3） 陽性對(duì)照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光，陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。
4. 一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。
間接免疫熒光法測(cè)抗體
基本原理
染色程序分為兩步，步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。
試劑與儀器
l 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
l 緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。
l 熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋 。
l 搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
l 有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）
l 熒光顯微鏡
l 玻片架
l 濾紙
l 37℃溫箱等。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
3. 取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩 。
4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。
5. 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
6. 重復(fù)操作3。
7. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。
8. 熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。
注意事項(xiàng)
1. 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過長(zhǎng) ，會(huì)使熒光減弱。
2. 每次試驗(yàn)時(shí) ，需設(shè)置以下三種對(duì)照：
（1） 陽性對(duì)照：陽性血清+熒光標(biāo)記物
（2） 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物
（3） 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物
3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤(rùn)，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。