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熒光及可視化 RT-LAMP 擴(kuò)增試劑盒簡(jiǎn)介
閱讀：1286 發(fā)布時(shí)間：2022-8-2| 產(chǎn)品及特點(diǎn) | 本產(chǎn)品是根據(jù)本公司的雙染料 RT-LAMP 技術(shù)開發(fā)的熒光和可見光雙模式檢 測(cè)試劑盒 ，它既可以用于熒光 RT-LAMP 擴(kuò)增及檢測(cè) ，也可以用于可視化 RT-LAMP 擴(kuò)增及檢測(cè) ，適用于各種針對(duì)核酸的快速定性檢測(cè)。 本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)： 1. 含可見光和熒光染料， 既可以用金屬浴和水浴擴(kuò)增用可見光肉眼判斷結(jié)果 ，也可 用熒光 PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。 2. 內(nèi)含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。 3. 特異性比 RT-PCR 高， 因?yàn)?RT-LAMP 擴(kuò)增使用 4-6 條引物而不是兩條。 4. 靈敏性可達(dá) 10 拷貝/反應(yīng)以下 (隨引物而不同) ，故假陰性率更低。 5. 只可用于科研 ，只可進(jìn)行定性檢測(cè) ，不能用于定量檢測(cè)。 | |||||||
| 規(guī)格及成分 | 成 份 | 編號(hào) | 塑料盒包裝 | |||||
| MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(含 RI)， 200U/μL | 60905a | 50 μL (黃蓋) | ||||||
| 4 ×RT Buffer (含 dNTP) | 60905b | 250 μL (白蓋) | ||||||
| 5 ×熒光及可視化 LAMP MagicMix | 200603a | 200 μL (綠蓋) | ||||||
| Bst DNA 聚合酶 2.0 ( 8U/uL) | 200403 | 50 uL (紅蓋) | ||||||
| RT-LAMP 陽(yáng)性對(duì)照模板-引物混合物 | 130923a | 20 μL (黃蓋) | ||||||
| 超純水 | 100935 | 1mL (亮黃蓋) | ||||||
| 使用手冊(cè) | 200603sc | 1 份 | ||||||
| 運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸， -20 ℃保存，保存期限為一年。 | |||||||
| 自備試劑 | RT-LAMP 模板及 RT-LAMP 引物、PCR 級(jí)石蠟油 (僅對(duì)使用金屬浴或水浴者) 。 | |||||||
| 使用方法 | 準(zhǔn)備工作：如果使用水浴鍋或金屬浴， 需要在實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)前打開并調(diào)到 60-65℃。如果 用金屬浴，還必須在孔中加水以填充金屬孔和反應(yīng)管間的空隙。金屬浴和水浴溫控遠(yuǎn) 遠(yuǎn)不如 PCR 儀器， 所以使用前需要用陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照 (水) 做預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)可用。 一、 樣品 RNA 的制備 1. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) RNA 提取試劑盒兼容。 2. 如果有 N 個(gè)樣品， 則至少需要做 N+2 個(gè)樣品制備， 包括一個(gè)制備陽(yáng)性對(duì)照(制備 時(shí)加入自備的跟要檢測(cè)的靶分子相同的陽(yáng)性對(duì)照模板， 一起經(jīng)歷提取過程) 和一個(gè) 制備陰性對(duì)照 (用水替代樣品)。最后 N+2 個(gè)樣品一起進(jìn)行 RNA 提取操作，得 到 N+2 個(gè) RNA 樣品。 二、 合成 1st-strand cDNA 3. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系: | |||||||
| 成分 | 加入量 | |||||||
| 自備 RNA 模板 總 RNA 或 poly(A) mRNA 或?qū)Ｒ坏?/span> RNA 注意 ：RNA 樣品不能有基因組 DNA 污染。 |
100-500 ng 10-500 ng 0.01pg-500ng | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 自備引物 F3 | 1 μL | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 4 ×RT Buffer (含 dNTP) | 5 μL | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 自備 RNase-free 水 | 補(bǔ)水到 19 μL | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 4. 70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴。 5. 37℃保溫 5 分鐘。對(duì)富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的高 GC RNA 模板，可改成 45℃保溫 5 分鐘。 6. 加入 1 μL (=200 U) MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(含 RI) ，終體積為 20μL。 7. 42℃保溫 60 分鐘。 8. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 LAMP 模板使用，不需要純化。 三、 熒光及可視化 LAMP 擴(kuò)增及檢測(cè) ( 20μL 體系) 9. 反應(yīng)設(shè)置：如果有 N+2 個(gè) cDNA 樣品，則最好設(shè)置 N+4 個(gè) LAMP 擴(kuò)增，增加 LAMP 陰性對(duì)照和 LAMP 陽(yáng)性對(duì)照各 1 個(gè)。在 N+4 個(gè) 0.2mL PCR 管中加入下列成分：
10. 混勻后進(jìn)行擴(kuò)增。由于本產(chǎn)品含雙染料， 可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇下列三種方式進(jìn) 行擴(kuò)增和檢測(cè)。 11. 如果使用 PCR 儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增，肉眼檢測(cè)，則必須先在每個(gè)反應(yīng)管中 加 30 μL 自備的石蠟油，否則保溫期間反應(yīng)體系的水分會(huì)蒸發(fā)，影響反應(yīng)效率(如 果使用 PCR 儀器并開啟熱蓋，則可以不加石蠟油)。 60-65℃保溫 90 分鐘，肉 眼觀察管內(nèi)液體顏色。 12. 如果使用熒光定量 PCR 儀： 設(shè)為 60-65℃保溫 1 分鐘/循環(huán)， 90 個(gè)循環(huán)， 每分 | |||||||||||||||||||||||||||||||
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| 鐘在 FAM 通道采集一次熒光信號(hào)。 13. 如果使用 PCR 儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增，再使用 qPCR 儀進(jìn)行終點(diǎn)法熒光讀數(shù)： 則在擴(kuò)增前和擴(kuò)增后，分別在 qPCR 儀器上測(cè)熒光讀數(shù)(溫度設(shè)為 60-65 ℃， 1 次循環(huán)，每次循環(huán) 1 分鐘，在 FAM 通道采集一次熒光信號(hào)。注意： 測(cè)熒光讀數(shù)必 須在 65℃進(jìn)行) 。擴(kuò)增反應(yīng)按 60-65 ℃ ，90 分鐘進(jìn)行。 四、 結(jié)果分析及解讀 14. 如果是用普通 PCR 儀器、水浴或金屬浴進(jìn)行的擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后只能肉眼判斷結(jié) 果。將反應(yīng)管放置在白色背景(如白紙) 前觀察。擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)液將呈現(xiàn) 藍(lán)色，無模板和無引物的陰性對(duì)照將呈淺藍(lán)色。如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)液不呈 現(xiàn)藍(lán)色，或無模板和無引物的陰性對(duì)照任何一個(gè)呈現(xiàn)藍(lán)色，則說明試劑有問題， 實(shí) 驗(yàn)無效。請(qǐng)跟廠家聯(lián)系。 15. 如果實(shí)驗(yàn)有效， 則分析 N+2 個(gè)樣品管的結(jié)果。如果樣品管反應(yīng)液的顏色接近擴(kuò)增 陽(yáng)性對(duì)照管則說明有擴(kuò)增，如果接近無模板和無引物的陰性對(duì)照， 則說明無擴(kuò)增。 反應(yīng)結(jié)果示例見左圖(9 為陰性， 10 為陽(yáng)性) 。 16. 如果是用熒光 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增， 則可分析擴(kuò)增曲線和 Ct。試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照 的 Ct 將小于 60，如果大于 60，說明試劑可能失效， 需跟廠家聯(lián)系。無模板陰性 對(duì)照和無引物陰性對(duì)照的 Ct 將大于 90。如果任何小于 90，則說明試劑或環(huán)境被 污染，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或跟廠家聯(lián)系。如果陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照 Ct 都在正常范圍，則 分析樣品的 Ct。Ct 小于 60 的判斷為陽(yáng)性，大于 90 判為陰性， 在 60-90 之間則 需要重復(fù)檢測(cè)。 17. 如果使用 PCR 儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增，肉眼檢測(cè)，再使用熒光定量 PCR 儀 進(jìn)行終點(diǎn)法熒光讀數(shù)來判斷陰陽(yáng)性， 則先比較陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照樣品 擴(kuò)增后信號(hào)增幅應(yīng)該超過 100%， 陰性對(duì)照擴(kuò)增后信號(hào)增幅應(yīng)該低于 50%，否則 實(shí)驗(yàn)無效， 請(qǐng)與廠家聯(lián)系。如果兩個(gè)對(duì)照均有效，則比較樣品擴(kuò)增前后熒光讀數(shù)的 差值。如果擴(kuò)增后熒光信號(hào)增幅低于 50%，則判斷為陰性。如果熒光信號(hào)增幅高 于 100%，則判斷為陽(yáng)性。熒光信號(hào)增幅在 50- 100%之間的， 則需要重測(cè)。 18. 當(dāng)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)和可視化檢測(cè)同時(shí)用于判讀結(jié)果時(shí)，如果彼此不一致， 以實(shí)時(shí)熒光 LAMP 的數(shù)據(jù)為準(zhǔn)。一般可視化結(jié)果滯后實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果 20-30 分鐘，也就是 說，在 qPCR 儀上第 30 分鐘時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性的樣品， 其反應(yīng)液的顏色變化一般在第 50-60 分鐘時(shí)才能觀察到。 |
| 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | 免核酸純化病毒保存液， PCR 級(jí)石蠟油 |