在三十億年的進(jìn)化過(guò)程中，大自然通過(guò)重復(fù)的隨機(jī)突變和體內(nèi)選擇編碼蛋白的*功能，產(chǎn)生了大量蛋白質(zhì)。這種自然進(jìn)化的例子啟發(fā)了研究人員在過(guò)去二十年中開(kāi)發(fā)了體外排列蛋白的策略。

在應(yīng)用的各種策略中，出現(xiàn)了三種主要的強(qiáng)大技術(shù)。

通過(guò)dNTP類(lèi)似物的隨機(jī)突變

這種方法基于將突變性dNTP類(lèi)似物，如8-0xo-dGTP和dPTP，通過(guò)PCR并入擴(kuò)增的DNA片段。在僅存在四種天然dNTP的情況下進(jìn)行第二步驟PCR，淘汰突變性dNTP，實(shí)現(xiàn)高達(dá)20%的突變率。

1.JBS dNTP突變?cè)噭┖?nbsp;#PP-101

通過(guò)錯(cuò)誤傾向PCR的隨機(jī)突變

由Caldwell和Joyce（1992）開(kāi)發(fā)，這種方法使用在引起DNA聚合酶錯(cuò)誤率增加的條件下的PCR反應(yīng)，在感興趣的基因中引入突變。通過(guò)錯(cuò)誤傾向PCR實(shí)現(xiàn)的突變率在0.6-2.0%范圍內(nèi)。

2.JBSError傾向試劑盒IPP-102

通過(guò)DNA Shuffling的隨機(jī)突變

由Stemmer（1994）開(kāi)發(fā)，DNA Shuffling通過(guò)隨機(jī)切割一個(gè)基因或一組相關(guān)基因，然后通過(guò)自引物PCR反應(yīng)重新組裝片段來(lái)生成庫(kù)。這種方法允許來(lái)自不同相關(guān)基因的序列重組。整體突變率大約為0.7%。

3.艾美捷DNA Shuffling試劑盒 #PP-103

Jena Bioscience現(xiàn)在為每種技術(shù)的“即用型"提供所有必要的組件，單獨(dú)的試劑盒，并附有簡(jiǎn)化的文檔，以Z大化成功。

一般實(shí)驗(yàn)室用途。

運(yùn)輸：在凝膠包上運(yùn)輸

儲(chǔ)存條件：存儲(chǔ)在-20℃

附加儲(chǔ)存條件：避免凍融循環(huán)

保質(zhì)期：12個(gè)月

通過(guò)DNA Shuffling的隨機(jī)突變

DNA Shuffling是一種在體外有目標(biāo)地進(jìn)化蛋白質(zhì)的強(qiáng)大技術(shù)。它通過(guò)來(lái)自一個(gè)或幾個(gè)相關(guān)基因的基因片段的重組生成結(jié)構(gòu)多樣性。DNA Shuffling可以分為單基因 Shuffling和多基因 Shuffling（圖1）。在單基因 Shuffling中，只有一個(gè)基因被消化，然后重新組裝，導(dǎo)致點(diǎn)突變的比率大約為0.7%。DNA Shuffling在蛋白質(zhì)進(jìn)化中的主要應(yīng)用是多基因 Shuffling（通常稱(chēng)為分子育種）。在這項(xiàng)技術(shù)中，幾個(gè)同源DNA序列被消化，然后重新組裝。結(jié)果是包含額外點(diǎn)突變的嵌合基因庫(kù)。

DNA Shuffling中的關(guān)鍵步驟是對(duì)感興趣的基因進(jìn)行消化，以產(chǎn)生合適大小的片段。因此，試劑盒中的所有試劑都經(jīng)過(guò)優(yōu)化，以便在方便的時(shí)間框架內(nèi)獲得所需大小的片段（圖2）。通常，使用平均大小為70-280 bp的片段會(huì)取得最佳結(jié)果。請(qǐng)注意，wan全的DNase I消化會(huì)產(chǎn)生非常短的片段，這些片段無(wú)法通過(guò)隨后的PCR進(jìn)行擴(kuò)增。

圖1：DNA混洗的一般類(lèi)型

圖2:1000bp DNA片段的DNA酶I消化與孵育時(shí)間的函數(shù)關(guān)系（37℃下1μg DNA+0.1單位DNA酶I）

DNA Shuffling試劑盒參考文獻(xiàn)：

Crameri et al. (1998) DNA shuffling of a family of genes from diverse speciesaccelerates directed evolution. Nature 391:288.

Patten et al. (1997) Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals andvaccines. Curr. Opin. Biotechnol. 8:724.

Stemmer (1994) DNA shuffling by random fragmentation and reassembly. Invitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:10747.

Stemmer (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature370:389.