從1993年發(fā)現(xiàn)miRNA開(kāi)始，有關(guān)miRNA的探索與發(fā)現(xiàn)就沒(méi)有停止過(guò)。miRNA雖只有很短的一段核苷酸，卻通過(guò)調(diào)控大量的靶基因，在基因表達(dá)中扮演了重要角色。小身體，大能量，說(shuō)的就是它——microRNA（簡(jiǎn)稱miRNA）。

miRNAs是一類長(zhǎng)約20nt~24nt長(zhǎng)度的單鏈小RNA，由細(xì)胞內(nèi)源產(chǎn)生的發(fā)卡（hairpin）結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄本加工而來(lái)。miRNAs的加工成熟是一個(gè)經(jīng)歷了細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)空間轉(zhuǎn)變、多種酶和輔助蛋白協(xié)調(diào)完成的受到多層次調(diào)節(jié)的多步驟精密反應(yīng)：1）DNA經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄形成初級(jí)產(chǎn)物pri-miRNA；2）pri-miRNA在核內(nèi)經(jīng)Drosha酶剪切形成miRNA前體pre-miRNA；3）pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿，經(jīng)Dicer酶剪切形成成熟的miRNA。miRNA的功能主要是沉默靶基因表達(dá)：在RISC沉默復(fù)合體協(xié)助下，miRNA與其靶基因mRNA的3'-UTR（3'端的非翻譯區(qū)）結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄或誘導(dǎo)mRNA降解，從而抑制蛋白翻譯。

因?yàn)閙iRNA的長(zhǎng)度比較短，因此用常規(guī)的qPCR法很難對(duì)其直接定量。所以，在針對(duì)miRNA的PCR技術(shù)中，必須要延長(zhǎng)待測(cè)miRNA的長(zhǎng)度，構(gòu)建出一個(gè)足夠長(zhǎng)的PCR模板，才能進(jìn)一步應(yīng)用PCR技術(shù)來(lái)定量分析?，F(xiàn)在常用的對(duì)miRNA的定量方法主要有兩種，分別為莖環(huán)引物法、加尾法。

頸環(huán)引物法

需要自己設(shè)計(jì)一種特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，一般長(zhǎng)度約為45bp。整個(gè)莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄引物由兩個(gè)部分組成：①通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，自身形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)不僅能夠有效地延長(zhǎng)miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度，同時(shí)它自身互補(bǔ)的構(gòu)象可以避免與其他同源基因結(jié)合，減少了非特異性擴(kuò)增的幾率。② 5~8個(gè)與目的miRNA的3’端反向互補(bǔ)的堿基。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物與miRNA 分子的3’端結(jié)合，并在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，獲得人為加長(zhǎng)的miRNA第1鏈cDNA。

莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法利用可以正確折疊為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物對(duì)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以獲得人為加長(zhǎng)后的miRNA cDNA第1鏈，然后利用合適的退火溫度將反轉(zhuǎn)錄引物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)并與PCR擴(kuò)增的正反向引物結(jié)合，再通過(guò)染料法或探針?lè)ㄟM(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。這種方法的特異性較高，但是對(duì)引物的要求也很高，需要引物在反轉(zhuǎn)錄階段形成莖環(huán)式的正確構(gòu)型，因此設(shè)計(jì)起來(lái)較為繁瑣和困難。而且針對(duì)同一樣本中不同的目的miRNA，就需要配制不同的逆轉(zhuǎn)錄體系。所以這種方法比較適合對(duì)樣本中少量幾個(gè)miRNA的精確定量檢測(cè)。

加尾法

加尾反轉(zhuǎn)錄法利用poly(A)聚合酶為成熟的miRNA加上poly(A)尾巴，然后用5’端帶通用標(biāo)簽的Oligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄引物，獲得人為加長(zhǎng)的miRNA cDNA第1鏈，后用與通用標(biāo)簽序列互補(bǔ)的反向引物進(jìn)行染料法或者探針?lè)ǖ臒晒舛縋CR檢測(cè)。這種方法可以批量地將所有成熟miRNA加上poly(A)尾巴，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和檢測(cè)，無(wú)需繁瑣的引物設(shè)計(jì)，因此被很多實(shí)驗(yàn)室采用。

Genecopoeia基于加尾法的All-in-One™ miRNA qRT-PCR 系列試劑盒和驗(yàn)證引物，用于miRNA表達(dá)量的高效檢測(cè)。

All-in-One™ miRNA qRT-PCR 系列試劑盒包括All-in-One™ miRNA qRT-PCR Detection Kit（miRNA檢測(cè)試劑盒）、All-in-One™ miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit（miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）和All-in-One™ miRNA qPCR Kit（miRNA定量試劑盒）。其中All-in-One™ qRT-PCR Detection Kit包括RT（逆轉(zhuǎn)錄）和qPCR（定量檢測(cè)）兩部分試劑，利用基于SYBR® Green的qPCR技術(shù)，可對(duì)低至20 pg的Total RNA（或者低至10 pg的small RNA）進(jìn)行快速、準(zhǔn)確定量。

miRNA qPCR定量檢測(cè)試劑盒：

多合一miRNA第1鏈cDNA合成試劑盒2.0，貨號(hào)：QP113；

多合一miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒2.0，貨號(hào)：QP115

All-in-One™ miRNA系列試劑靈敏度高、特異性強(qiáng)、性價(jià)比高

• 可對(duì)檢測(cè)低至20 pg的Total RNA（或者低至10 pg的small RNA）
• 僅檢測(cè)成熟miRNA

驗(yàn)證引物

HsnRNA U6 primer，貨號(hào)：HmiRQP9001；

M丨snRNA U6 primer，貨號(hào)：MmiRQP9002

All-in-One™ miRNA 驗(yàn)證引物

• 每條All-in-One™ miRNA 特異驗(yàn)證引物均使用磚利算法設(shè)計(jì)并經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確證。
• 在miRNA定量PCR試驗(yàn)中，該系列驗(yàn)證引物與基于SYBR® Green I 的All-in-One™ miRNA qRT-PCR Kit配套使用，性能可靠，重復(fù)性好。

引物驗(yàn)證結(jié)果

All-in-One™ miRNA qPCR pimer經(jīng)驗(yàn)證產(chǎn)生單一擴(kuò)增產(chǎn)物，融解曲線均呈單一銳鋒，電泳條帶均呈單一條帶，且與目標(biāo)miRNA相符。由10種人組織混合樣本的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA作為引物驗(yàn)證的模板。qPCR反應(yīng)由終濃度0.2 µM的引物和All-in-One™ qPCR Mix配合完成。（A）驗(yàn)證結(jié)果的擴(kuò)增曲線，（B）驗(yàn)證結(jié)果的熔解曲線。