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　　一、人表皮永生化細(xì)胞HACAT的培養(yǎng)步驟：

　　1、細(xì)胞復(fù)蘇：將含有1ml細(xì)胞懸液的冷凍管在37℃水浴中搖晃解凍，加入5ml培養(yǎng)基混勻。1000rpm離心5分鐘，棄上清，加入4-6ml*培養(yǎng)基吹勻。然后，將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中過夜培養(yǎng)（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm培養(yǎng)皿中）培養(yǎng)過夜。第二天，更換液體并檢查細(xì)胞密度。

　　2、細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，可進(jìn)行傳代。
 

　　二、貼壁細(xì)胞可采用以下方法傳代：

　　1、棄去培養(yǎng)上清液，用不含鈣鎂離子的PBS洗滌細(xì)胞1-2次。

　　2、在培養(yǎng)瓶中加入1-2ml消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況。如果大部分細(xì)胞變圓脫落，迅速將其放回控制臺，輕敲培養(yǎng)瓶數(shù)次，然后加入5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化。

　　3、輕輕吹打細(xì)胞，待*脫落后吸出，1000rpm離心8-10分鐘，棄上清，加1-2ml培養(yǎng)基吹勻。

　　4、按5-6ml/瓶加入培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2～1：5的比例分裝到裝有5-6ml培養(yǎng)液的新皿或瓶中。

　　

　　三、對于懸浮細(xì)胞，可采用以下方法進(jìn)行傳代：

　　方法1：收集人表皮永生化細(xì)胞HACAT，1000rpm離心8-10分鐘，棄上清，加1-2ml培養(yǎng)基吹勻。將細(xì)胞懸液按1:2至1:5的比例分入裝有8ml培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿或瓶中。

　　方法2：換一半介質(zhì)即可。棄去一半培養(yǎng)基后，將剩余的細(xì)胞懸浮，將細(xì)胞懸浮液以1:2至1:3的比例分裝到裝有8ml培養(yǎng)基的新皿或瓶中。

　　三、細(xì)胞冷凍保存：細(xì)胞生長良好時(shí)可進(jìn)行冷凍保存。貼壁細(xì)胞冷凍后棄去培養(yǎng)基加入少量胰蛋白酶。細(xì)胞變圓脫落后，離心收集。將它們以1000rpm離心8-10分鐘以去除上清液。根據(jù)冷凍量加入血清和DMSO。冷凍比例為90%FBS+10%DMSO。

　　PS：如果客戶收到2ml管狀細(xì)胞人表皮永生化細(xì)胞HACAT，收到細(xì)胞后，用75%酒精噴灑整管消毒，放入超凈臺或安全柜，嚴(yán)格無菌操作；將管狀細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿中，加入*培養(yǎng)基約5ml，混勻，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，然后檢查細(xì)胞密度：如果密度不超過80%，換溶液以繼續(xù)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)或酌情冷凍。如果密度超過80%，可以直接通過（方法同上）。