2022年，“生物大分子與微生物組"被列為國自然重點項目，由此掀起了空間蛋白組學技術的研究熱潮，其中免疫組織化學（IHC，Immunohistochemistry）作為最早的空間蛋白組學技術，衍生出了很多新興的研究方法。IHC是利用抗原-抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色以確定細胞內(nèi)抗原，并對其進行定位、定性及定量的研究。
隨著空間蛋白組學技術的不斷發(fā)展，利用IHC進行的傳統(tǒng)多標記方案，也就是在連續(xù)切片上進行單標染色，很明顯已經(jīng)不能適用于研究人員的高通量檢測需求。于是，mIHC技術就應運而生了，它可以做到在一個樣本中進行多重熒光染色。相比于傳統(tǒng)的組化技術，mIHC在復雜的腫瘤微環(huán)境中蛋白表達和共定位分析或其他生理過程中有較高應用價值，尤其是在樣本數(shù)較少的情況下，可以做到同時檢測多達10種熒光染料。
目前，mIHC有兩大技術——經(jīng)典的TSA技術和新興的SignalStar技術。那么，這兩種技術我們該怎么去選擇呢？接下來就帶大家一起來看看吧～
Part 01 TSA技術簡介
1．TSA技術原理
酪氨酸信號放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技術，是利用辣根過氧化酶 (Horseradish Peroxidase, HRP) 對靶蛋白進行高密度原位標記的酶學檢測方法。簡單來說，就是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結合；然后微波清洗，前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素還留存在樣品上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，最后去檢測結果。
圖1 TSA技術原理圖
2. TSA操作步驟
1）使用TSA技術，你需要準備：嚴格驗證的高特異性抗體、HRP偶聯(lián)的針對一抗種屬亞型特異的二抗、酪胺熒光素、多光譜成像系統(tǒng)；
2）孵育一抗二抗：利用二抗上帶有的HRP催化后續(xù)添加入體系的非活性酪胺熒光素；
3）加入酪胺：酪胺熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結合；
4）微波清洗：通過微波清洗去除已連接的一抗和二抗，共價結合的熒光素還留存在樣品上，再孵育新的靶點的一抗和二抗；
5）檢測：等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，使用熒光顯微鏡檢測結果。
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Part 02 SignalStar™ Multiplex IHC技術簡介
1. SignalStar技術原理
SignalStar技術是使用帶有寡核苷酸標簽的特異性抗體，結合du有的信號放大系統(tǒng)并使用熒光成像檢測的多重免疫組化（mIHC) 技術，可在常規(guī)FFPE樣本中同時檢測3-8個靶標蛋白，且兼容常見下游成像平臺及分析軟件。
圖2 對石蠟包埋的人胃腺癌進行 SignalStar™ 多重免疫組化分析結果圖
2. SignalStar操作步驟
1）將寡核苷酸偶聯(lián)的抗體加入到經(jīng)過脫蠟，復水以及抗原修復處理的FFPE組織中；
2） 一次添加所有抗體，然后進行溫和固定；
3）互補寡核苷酸與前4個抗體的偶聯(lián)標簽雜交；
4）使用熒光寡核苷酸產(chǎn)生并放大信號(AF488, AF594, AF647, AF750)；
5）寡核苷酸連接；
6）寡核苷酸特異性酶去除所有熒光信號；
7）互補寡核苷酸與偶聯(lián)抗體上的寡核苷酸標簽進行第二輪雜交；
8）使用熒光寡核苷酸產(chǎn)生并放大信號(AF488, AF594, AF647, AF750)；
9）寡核苷酸連接。
圖3 SignalStar™實驗流程圖
Part 03 TSA 技術vs SignalStar技術
TSA技術與SignalStar技術各有優(yōu)缺點，對比如下：
TSA | SignalStar |
同時標記多種蛋白（最多9標10色） | 同時標記多種蛋白（最多8標9色） |
一抗來源不再受限（同種屬多標） | 一抗來源不再受限（同種屬多標） |
連接辣根過氧化物酶的同種屬二抗 | 熒光寡核苷酸不會導致表位遮蔽 |
強熒光防淬滅（無需避光操作） | 抗體一次性添加，節(jié)省時間 |
檢測靈敏度超高，成倍提高熒光信號（增強10-1000倍） | 檢測靈敏度超高 |
驗證靶標多 | 組織結構、抗原不容易破壞 |
成本較低 | 優(yōu)化過的實驗方案，試劑齊全，傻瓜式操作，開箱即用 |
實驗流程耗時長 | 驗證靶標有限 |
對于研究者來說，進行mIHC實驗需要準備抗體和多重熒光二抗試劑盒，可以提供4-7色的多色試劑盒及輔助試劑。除此之外，我們還可提供mIHC整體解決方案，包括試劑、服務等等。其中，愛必信多色服務最多九指標十色（含DAPI）的多重熒光免疫組化服務，樣本種屬涵蓋人、小鼠、大鼠、豬等；組織類型以腫瘤樣本居多，涵蓋肺、胃、肝、腎、腸等各大器官，甲狀腺、胰腺、唇腺、淚腺等各大腺體，另還有眼球、神經(jīng)、大腦等特殊樣本；切片類型涵蓋石蠟切片、組織芯片（TMA）、冰凍切片、大組織切片、厚切片等，并提供全片掃描和定量分析。
圖4 Absin全景多靶點染色成像分析平臺
Part 04常見問題解答
Q1：波修復抗原每一輪染色都要做嗎？可以用抗體洗脫液替代嗎？抗體洗脫液用在哪個步驟？
A1：染第一個抗體之前做抗原修復，是為了使被石蠟或者固定劑封閉的抗原決定簇重新暴露出來，使得抗體能夠識別到抗原；在染后面每一個抗體之前的抗原修復，目的是為了去除掉上一輪染色的抗體和殘留沒有結合上的染料，其實更準確的叫法是“抗體洗脫"，也就是說第一次的抗原修復是真正的抗原修復，后面的抗原修復實際上是“抗體洗脫"，“抗體洗脫"可以用抗體洗脫液(abs994)替換，特別是細胞、冰凍切片或者骨樣本，但第一次抗原修復不能被抗體洗脫液替代，冰凍切片可以不進行抗原修復，染色效果欠佳時，可以考慮嘗試進行抗原修復，推薦冰凍切片快速抗原修復液(5×)(abs9207)。
Q2：脫蠟水合步驟中“10%中性福爾馬林浸片10min，滅菌水洗片1min，重復3次"目的是什么？我們以前做石蠟切片的時候沒有這一步。
A2：這是后固定的步驟，固定充分的組織可以省略此步。
Q3：做好的多色片子，無法進行及時掃描，該如何保存？
A3：需要避光防震，在4℃條件下保存。
Q4：樣本可以做成冰凍切片嗎？
A4：可以的?？乖迯筒襟E不推薦用加熱的方法，推薦用抗體洗脫液(abs994)
Q5：所有操作要避光嗎？
A5：不需要，在常規(guī)環(huán)境下操作就可以，染料的熒光強度很高。
Q6：抗體修復液每一輪修復都要更換嗎？
A6：是的，每一輪都要根據(jù)抗體選擇相應的修復液。
Q7：染料的選擇會影響后染色嗎，有共定位的話怎么辦？
A7：共定位的情況，我們可以通過單一通道觀察來更好的檢測各指標的分布情況，染料不會對染色有影響，串色的情況需要預實驗做充足，包括抗體稀釋比例，染料與放大液比例，修復條件的確定。
Q8：多色用的一二抗各是什么種屬？
A8：多色的優(yōu)勢在于一二抗種屬無需特別要求，一抗根據(jù)樣本種屬選擇既可，二抗根據(jù)一抗選擇即可，多個抗體組合，種屬不會有影響。
Q9：抗體洗脫和微波修復哪種方式洗脫效果更好？
A9：微波修復洗脫更穩(wěn)定，抗體洗脫液對大多數(shù)抗體都管用，難洗的抗體延長洗脫時間就可以啦！
Q10：我的組織還有GFP蛋白，給結果的時候能排除干擾嗎？
A10：可以的，結果分析的時候可以避免綠色通道，分析軟件賦予的顏色是偽彩色，可以更換其他顏色。
Q11：在指標與染料的搭配以及染色順序上，有什么規(guī)律嗎？
A11：并沒有一個特別的線性關系，和蛋白的種類、表達量以及修復條件都有關系，所以會多因素考慮，多嘗試，預實驗很重要。
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