膠原蛋白是結(jié)締組織和內(nèi)臟器官細(xì)胞外基質(zhì)的主要構(gòu)造成分，在皮膚、肌腱、骨骼中分布最為廣泛。從遺傳和結(jié)構(gòu)上膠原蛋白分為許多類型。
膠原蛋白I（Collagen, Type I）是由2個(gè)α1 鏈和1個(gè)α2 鏈組成的異源多聚體（圖1），在37℃，中性pH 下自發(fā)形成三螺旋骨架，是一種優(yōu)秀的細(xì)胞培養(yǎng)用基質(zhì)，廣泛用于肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脊神經(jīng)節(jié)、肌肉細(xì)胞、施萬細(xì)胞、胚肺細(xì)胞、上皮細(xì)胞和其他大量細(xì)胞系。還能用于研究細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移以及發(fā)育過程中的組織形態(tài)發(fā)生。
圖1 膠原蛋白I分子模型
鼠尾膠原蛋白I 是根據(jù)Birkedal-Hansen 方法，通過醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備?？捎糜诎患?xì)胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)細(xì)胞表面粘附性，特別適合那些在普通培養(yǎng)器皿表面不易貼壁的細(xì)胞，比如成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞等原代細(xì)胞。還可用于三維膠的制備，模擬真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境，使得細(xì)胞在三維環(huán)境中生長(zhǎng)。
本品為溶于6mM HAc 的無菌溶液（圖2），濃度5mg/ml，每個(gè)批次產(chǎn)品皆通過細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試（包括三維空間培養(yǎng)）以保證質(zhì)量的可靠性。接下來我們了解鼠尾膠原蛋白I的兩種用途吧。
圖2 鼠尾膠原蛋白I (abs47014921)
一、細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被
組織培養(yǎng)器皿的表面包被推薦濃度為1-5μg/cm2，起始濃度可選5μg/cm2。建議根據(jù)具體細(xì)胞類型來優(yōu)化。
1、6mM HAc稀釋液的制備
本品以溶于6mM HAc（=0.36g/L HAc）的無菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH，建議用6mM HAc溶液做進(jìn)一步稀釋。配制方法：取34.5μl 冰醋酸（17.4M）加入100ml雙蒸水，充分混勻后即得到6mM HAc溶液，0.22μm濾膜過濾除菌后待用。
2、包被步驟
1）根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系以及優(yōu)化后的包被濃度來計(jì)算所需的膠原蛋白量，并加入相應(yīng)孔內(nèi)，確保膠原蛋白溶液覆蓋表面。
a. 以包被濃度為 5μg/cm2，先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白（5mg/ml）稀釋到合適的中間濃度，如50μg/ml， 然后參考表1 不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表來加量到各孔內(nèi)；
b. 以包被濃度為 2μg/cm2，先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白（5mg/ml）稀釋到合適的中間濃度，如12μg/ml，然后參考表1 不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表來加量到各孔內(nèi)；
表1 不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表
培養(yǎng)器皿 | 表面積（cm2,每孔或每皿） | 當(dāng)包被濃度：2ug/cm2，中間稀釋濃度12ug/ml，加入該稀釋液體積（ul） | 當(dāng)包被濃度：5ug/cm2，中間稀釋濃度50ug/ml，加入該稀釋液體積（ul） |
96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 | 0.3 | 50 | 30 |
24孔細(xì)胞培養(yǎng)板 | 1.9 | 300 | 190 |
12孔細(xì)胞培養(yǎng)板 | 3.8 | 600 | 380 |
6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 | 9.5 | 1580 | 950 |
35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 | 8 | 1330 | 800 |
60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 | 21 | 3500 | 2100 |
100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 | 55 | 9170 | 5500 |
2）室溫孵育1h，小心吸掉多余液體，用無菌PBS清洗3~4次后直接使用?；蛘呒油昴z原蛋白溶液后，在超凈臺(tái)內(nèi)開蓋過夜晾干。無菌條件下，包被好的器皿在4-25°C至少可保存3個(gè)月。
二、三維膠原的制備
當(dāng)鼠尾膠原蛋白I使用濃度>1mg/ml，pH 7.0左右皆可形成具有一定強(qiáng)度的三維膠，建議成膠濃度為1-2 mg/ml。
由于本品是以溶于6mM HAc的無菌溶液形式提供，在成膠過程需先加入0.06倍體積的0.1M NaOH中和。
1、需要溶液準(zhǔn)備（無菌、預(yù)冷）
10×細(xì)胞培養(yǎng)液（依據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞種類而定）、0.1M NaOH、無菌水（abs9259）
2、三維膠原制備（不含細(xì)胞）（以配制1ml，1mg/ml三維膠為例）：
1）取200μl膠原蛋白（5mg/ml）加到置于冰浴的離心管內(nèi)，加入690μl無菌水。之后加到12μl 0.1M NaOH【注：該步驟不能反，如果反過來把12μl 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)】，立即混勻。再加入100μl 10×細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。【注：混勻后pH為7.0左右，如果培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時(shí)需要用pH試紙測(cè)試】。
2）將培養(yǎng)器皿在室溫（25°C左右）放置20min待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。
三維膠原制備（含細(xì)胞）（以配制1ml，1mg/ml三維膠為例）：
a. 準(zhǔn)備好細(xì)胞懸液，并放置于冰浴中。b，將200μl膠原蛋白（5mg/ml）加到12μl 0.1M NaOH【注：該步驟不能反，如果反過來把12μl 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)】，立即混勻。再加入23μl 10×細(xì)胞培養(yǎng)液，立即混勻【注：混勻后pH為7.0左右，如果培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時(shí)需要用pH試紙測(cè)試】。再加入760μl 的細(xì)胞懸浮液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。
b. 將培養(yǎng)器皿在室溫（25°C左右）放置20min待膠凝固后，加入適當(dāng)體積細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
本期講解就到這里了，如有細(xì)胞培養(yǎng)問題，歡迎微信公眾號(hào)“愛必信生物"后臺(tái)留言
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表2 小愛細(xì)胞培養(yǎng)類產(chǎn)品推薦
貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 |
abs981 | 胎牛血清（特級(jí)） | 500ml |
abs972 | 胎牛血清（優(yōu)級(jí)） | 500ml |
abs974 | 胎牛血清（標(biāo)準(zhǔn)級(jí)） | 500ml |
abs9483 | 高糖DMEM培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9484 | RPMI-1640培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9505 | MEM培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9506 | α-MEM培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9554 | Ham's F-12培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9563 | Ham's F-12K培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9561 | DMEM/F-12培養(yǎng)基 | 500ml |
abs962 | PBS緩沖液 | 500ml |
abs970 | D-PBS緩沖液（不含 Ca2+ Mg2+） | 500ml |
abs971 | D-PBS緩沖液（含 Ca2+ Mg2+） | 500ml |
abs9257 | Hanks平衡鹽溶液（不含 Ca2+ Mg2+） | 500ml |
abs9258 | Hanks平衡鹽溶液（含 Ca2+ Mg2+） | 500ml |
abs47014938 | 胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%） ，含酚紅 | 100ml |
abs47047375 | 胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%），不含酚紅 | 100mL |
abs9479 | 無DMSO無血清細(xì)胞凍存液 | 100mL |
abs9417 | 無血清細(xì)胞凍存液 | 100mL |
abs9473 | 細(xì)胞凍存液（含血清） | 100mL |
abs9474 | 組織保存液 | 100ml |
abs9480 | 組織凍存試劑盒 | 30ml |
abs9486 | 模具 | 1個(gè)/套 |
abs9487 | 小刀 | 5片/包 |
abs9481 | 組織復(fù)蘇試劑盒 | 50ml |
abs42020125 | 卡那霉素B硫酸鹽 | 250mg |
abs42018967 | 硫酸慶大霉素溶液 | 10ml |
abs9244 | 青鏈雙抗 | 100ml |
abs9245 | 青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液 | 100ml |
abs42013298 | 兩性霉素B | 1g |
abs44071148 | 制霉菌素 | 1g |
abs9246 | 青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液 | 100ml |
abs9252 | 支原體檢測(cè)試劑盒 | 100T |
abs9375 | 支原體清除試劑 | 200uL×5 |
abs9376 | 支原體預(yù)防 | 500uL×4 |
abs816578 | 環(huán)丙沙星鹽酸鹽 | 500mg |
abs9374 | 水盤抑菌劑 | 20ml |
abs9371 | 水浴鍋抑菌劑 | 100ml |
abs9372 | 培養(yǎng)箱除菌劑 | 480ml |
abs9373 | 細(xì)胞房除菌劑 | 480ml |
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