很多小伙伴都疑惑，細(xì)胞被支原體污染后的特征是什么？如何鑒別細(xì)胞被支原體污染了？今天，我?guī)Т蠹曳窒韮蓚€(gè)支原體污染的案例，共同探尋一下細(xì)胞被支原體污染后的特征。
圖1 感染支原體的EBTr（牛胚氣管細(xì)胞）
先來觀察一下被支原體污染的牛胚氣管細(xì)胞（圖1），由成纖維樣逐漸變得類上皮樣；質(zhì)膜鋪展，潰爛；輪廓不清，邊界模糊。再看右圖，細(xì)胞處于邊增殖邊凋亡的狀態(tài)，漂浮凋亡細(xì)胞過多。
圖2 感染支原體的HT1080（人纖維肉瘤細(xì)胞）
接下來再觀察一下被支原體污染的人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080（圖2），由上皮樣逐漸變得類成纖維樣，胞體細(xì)長，和前面的牛胚氣管細(xì)胞形態(tài)變化剛好相反；偽足伸長，出現(xiàn)明顯的拉絲現(xiàn)象，表明細(xì)胞可能在“痛苦"地遷移。使用了支原體殺除試劑（abs9375），清除了支原體以后，如右圖所示，細(xì)胞逐漸恢復(fù)了上皮樣形態(tài)，拉絲減少。
圖3 細(xì)胞膜上的支原體集落
接下來，給大家展示貼附在細(xì)胞膜上的支原體集落（圖3），支原體是目前已知最小的原核生物，直徑大小在0.1-0.3um，比細(xì)菌還要小。支原體可在培養(yǎng)液、細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)增殖。單個(gè)支原體需要借助于電鏡才可以觀察到具體形態(tài)，圖中膜上的黑點(diǎn)為支原體集落。細(xì)胞背景干凈，形態(tài)沒有大的變化，但質(zhì)膜粗糙，布滿黑點(diǎn)。
總結(jié)下來，細(xì)胞被支原體污染的主要特征如下：
? 增殖減慢；
? 上清液澄澈；
? 背景干凈；
? 細(xì)胞形態(tài)異常（拉絲、鋪展）；
? 更換新的培養(yǎng)液細(xì)胞狀態(tài)沒有恢復(fù)。
細(xì)胞被支原體污染后的共性表現(xiàn)為細(xì)胞增殖減慢、上清液澄澈、背景干凈，這3點(diǎn)可以明確地排除真、細(xì)菌污染。值得一提的是，當(dāng)給細(xì)胞的營養(yǎng)體系不佳時(shí)，細(xì)胞也會(huì)表現(xiàn)出形態(tài)異常，所以，我們可以給細(xì)胞更換新的培養(yǎng)液，如果細(xì)胞也沒有恢復(fù)正常形態(tài)，此時(shí)判斷細(xì)胞極有可能被支原體“附身"了。
上述的判斷方法需要豐富的經(jīng)驗(yàn)積累，日常細(xì)胞培養(yǎng)中，我們還可以用PCR擴(kuò)增試劑盒檢測細(xì)胞是否有支原體污染。
 圖4 支原體檢測試劑盒（PCR法） | 產(chǎn)品優(yōu)勢： ? 本試劑盒檢測靈敏度高，可檢測低至20個(gè)拷貝的支原體； ? 實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，3小時(shí)即可完成； ? 已在多個(gè)支原體品種上做過驗(yàn)證。 |
表1 產(chǎn)品組分表
| 組分 | 名稱 | 規(guī)格 |
| A | Mycoplasma PCR Mix（2x） | 1ml |
| B | Mycoplasma Primer Mix | 100ul |
| C | Positive Control | 50ul |
| D | Mycoplasma Free Water | 1ml |
該試劑盒檢測到的支原體類別主要有：
M.fermentans（發(fā)酵支原體）、M.hyorhinis（豬鼻支原體）、M.arginini（精氨酸支原體）、M. Orale（口腔支原體）、M.hominis（人型支原體）、M.bovis（牛支原體）、M.pneumoniae（肺炎支原體）、M.pirum（梨支原體）、M.gallisepticum（雞毒支原體）、Ureaplasma spp（解脲支原體）、A.laidlawii（萊氏無膽甾原體） 等11種以上支原體。
作用原理：
試劑盒使用的混合引物是針對(duì)支原體16s rRNA序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的特異性引物，可直接使用細(xì)胞培養(yǎng)液作為PCR模板，特異性擴(kuò)增支原體DNA。
支原體檢測試劑盒（PCR法）使用方法
1、樣品準(zhǔn)備
取適量待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清于潔凈的PCR管中（如果是血清樣本，可用 Mycoplasma Free Water 稀釋），利用PCR儀95℃熱處理5min后作為模板；
2、PCR體系配制
每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對(duì)照（將1μL待檢樣品換成等量的Mycoplasma Free Water）與陽性對(duì)照（在1μL待檢樣品中加入0.5μL Positive Control后一起作為Template），實(shí)驗(yàn)時(shí)戴一次性口罩與手套，謹(jǐn)慎操作，防止操作不當(dāng)引入外源支原體污染；
3、PCR程序設(shè)置
表2
| Step | Temperature | Time | Cycles |
| Initial Denaturation | 98℃ | 2 min | 1 |
| Denaturation | 98℃ | 20S | |
| Annealing | 56℃ | 25S | 30 |
| Extension | 72℃ | 10S | |
| Final extension | 72℃ | 5min | 1 |
| Hold | 4-16℃ | Forever |
4、凝膠電泳
取10μL PCR產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；
5、結(jié)果分析
每次實(shí)驗(yàn)通過與陰性對(duì)照、陽性對(duì)照檢測結(jié)果比較確認(rèn)樣品支原體污染情況，陽性條帶大小500bp左右。如陰性對(duì)照檢測結(jié)果中有條帶很有可能是PCR體系中出現(xiàn)污染，建議重新實(shí)驗(yàn)確認(rèn)結(jié)果。如有必要，也可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)測序，以確定具體的支原體種屬。
如果您的細(xì)胞真的“中鏢"了，也不要怕，我們的支原體殺除試劑為您的細(xì)胞披荊斬棘，保駕護(hù)航。
產(chǎn)品優(yōu)勢：
? 特異性清除培養(yǎng)基中的支原體；
? 只需要3-6天，便可以有效清除支原體；
? 活性成分為多肽類，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性；
? 對(duì)細(xì)胞幾乎無毒性，在100多種細(xì)胞上進(jìn)行過驗(yàn)證，包括但不限于 HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等；
? 廣譜性，可替代雙抗，可以清除常見的革蘭氏陰性和陽性菌；
? 可直接加入血清、培養(yǎng)基中，用于清除支原體污染；
使用方法：
1、收到貨后，將試劑管瞬時(shí)離心（3000rpm，3～5s）保存。
2、推薦稀釋比例為1:1000。例如10mL的培養(yǎng)基加入10μL的Treatment混勻。
3、棄去舊的培養(yǎng)基，用PBS將細(xì)胞清洗干凈，再加入含有支原體清除劑的新鮮培養(yǎng)基，1天1次， 連續(xù)處理3天；或者2天1次，連續(xù)處理5～6天。若細(xì)胞污染非常嚴(yán)重時(shí)，需延長處理時(shí)間。
4、若細(xì)胞對(duì)支原體清除劑敏感，或生長明顯被抑制時(shí)，請參考以下推薦參數(shù)。
表3
| 大部分細(xì)胞 | 部分敏感細(xì)胞 | 少部分極敏感細(xì)胞 | |
| 稀釋比例 | 1：1000 | 1：2000 | 1：3000 |
| 處理時(shí)間 | 3天 | 6天 | 10天 |
5、處理完畢后，加入新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中可添加支原體預(yù)防劑（abs9376）預(yù)防支原體再次污染。
本期講解就到這里了，如有細(xì)胞培養(yǎng)問題，歡迎微信公眾號(hào)后臺(tái)留言，或者掃描下方二維碼加入我們微信群交流~
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表4 細(xì)胞培養(yǎng)類產(chǎn)品推薦
貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 |
abs981 | 胎牛血清（特級(jí)） | 500ml |
abs972 | 胎牛血清（優(yōu)級(jí)） | 500ml |
abs974 | 胎牛血清（標(biāo)準(zhǔn)級(jí)） | 500ml |
abs9483 | 高糖DMEM培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9484 | RPMI-1640培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9505 | MEM培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9506 | α-MEM培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9554 | Ham's F-12培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9563 | Ham's F-12K培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9561 | DMEM/F-12培養(yǎng)基 | 500ml |
abs962 | PBS緩沖液 | 500ml |
abs970 | D-PBS緩沖液（不含 Ca2+ Mg2+） | 500ml |
abs971 | D-PBS緩沖液（含 Ca2+ Mg2+) | 500ml |
abs9257 | Hanks平衡鹽溶液（不含 Ca2+ Mg2+) | 500ml |
abs9258 | Hanks平衡鹽溶液（含 Ca2+ Mg2+) | 500ml |
abs47014938 | 胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%） ，含酚紅 | 100ml |
abs47047375 | 胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%），不含酚紅 | 100mL |
abs9479 | 無DMSO無血清細(xì)胞凍存液 | 100mL |
abs9417 | 無血清細(xì)胞凍存液 | 100mL |
abs9473 | 細(xì)胞凍存液（含血清） | 100mL |
abs9474 | 組織保存液 | 100ml |
abs9480 | 組織凍存試劑盒 | 30ml |
abs9486 | 模具 | 1個(gè)/套 |
abs9487 | 小刀 | 5片/包 |
abs9481 | 組織復(fù)蘇試劑盒 | 50ml |
abs42020125 | 卡那霉素B硫酸鹽 | 250mg |
abs42018967 | 硫酸慶大霉素溶液 | 10ml |
abs9244 | 青鏈雙抗 | 100ml |
abs9245 | 青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液 | 100ml |
abs42013298 | 兩性霉素B | 1g |
abs44071148 | 制霉菌素 | 1g |
abs9246 | 青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液 | 100ml |
abs9252 | 支原體檢測試劑盒 | 100T |
abs9375 | 支原體清除試劑 | 200uL×5 |
abs9376 | 支原體預(yù)防 | 500uL×4 |
abs816578 | 環(huán)丙沙星鹽酸鹽 | 500mg |
abs9374 | 水盤抑菌劑 | 20ml |
abs9371 | 水浴鍋抑菌劑 | 100ml |
abs9372 | 培養(yǎng)箱除菌劑 | 480ml |
abs9373 | 細(xì)胞房除菌劑 | 480ml |
Absin特色產(chǎn)品線：
WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...
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