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多重免疫組化VS免疫熒光

閱讀：2342 發(fā)布時(shí)間：2020-12-17

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique，IF ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。

多重免疫組化（mIHC）：主要的技術(shù)原理來(lái)自TSA技術(shù)，TSA即酪酰胺信號(hào)放大(Tyramide signal amplification)是一類(lèi)利用辣根過(guò)氧化酶（HRP）對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法。該技術(shù)可與高性能染料Alexa Fluor®、傳統(tǒng)熒光染料和比色檢測(cè)系統(tǒng)相兼容。 TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的過(guò)氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn))，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周?chē)牡鞍讱埢?包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積，與隨后加入的Streptavidin—HRP/熒光基團(tuán)結(jié)合，經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以結(jié)合大量的酶分子or熒光基團(tuán)，結(jié)果使其檢測(cè)信號(hào)得到幾何級(jí)放大。

mIHC和IP的區(qū)別：

	多重免疫組化(mIHC)	免疫熒光(IP)
靶點(diǎn)數(shù)量	可同時(shí)染色7色（含dapi）	一般標(biāo)記三種(含dapi)大于三種效果差
一抗種類(lèi)	同一種屬的不同抗體即可滿足要求	不同種屬的不同抗體
二抗種類(lèi)	不同種屬的不同抗體	連接熒光探針的不同種屬二抗
染色策略	分步染色，多次重復(fù)進(jìn)行免疫組化操作	樣本抗原的空間位置的差異，需要設(shè)計(jì)復(fù)雜的染色策略。樣本/靶點(diǎn)的差異導(dǎo)致染色策略的差異，染色過(guò)程復(fù)雜、多變
染色效果	高染色分辨率和染色特異性，信號(hào)強(qiáng)度更強(qiáng),更穩(wěn)定,淬滅時(shí)間更長(zhǎng)，無(wú)背景影響，各靶點(diǎn)的信噪比大大提高，尤其適合組織基于單細(xì)胞的定量分析	亮度較弱,容易淬滅,各種抗體間存在互相影響，背景較高，對(duì)基于單細(xì)胞的定量分析不利。
實(shí)驗(yàn)成本	1同一種屬的一抗和二抗，價(jià)格相對(duì)便宜。 2簡(jiǎn)單的染色策略和無(wú)需任何重復(fù)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，即可掌握整個(gè)染色技術(shù)，大大縮小了預(yù)實(shí)驗(yàn)的材料損耗。 3一抗和二抗工作濃度更低,單次費(fèi)用更低	1不同種屬的抗體價(jià)格存在差異，一般種屬稀少的價(jià)格高。 2不同種屬的二抗，價(jià)格存在差異，一般稀少的種屬價(jià)格高。 3尋找合適的染色策略，復(fù)雜的多次重復(fù)的預(yù)實(shí)驗(yàn)大大的增加了實(shí)驗(yàn)成本
應(yīng)用范圍	二抗具備通用性，因此實(shí)驗(yàn)室中所有的研究領(lǐng)域均可使用	二抗不具備通用性，實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用領(lǐng)域受到局限

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