NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）試劑盒說明書

                                   分光光度法 50管/48樣

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義： 

NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

測定原理：

NOX能夠?qū)ADH氧化為NAD，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍（DCPIP）的還原相偶聯(lián)，藍色的DCPIP被還原為無色的DCPIP，在600nm下測定藍色DCPIP的還原速率計算出NADH氧化酶活性的大小。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水

試劑的組成和配制：

試劑一：液體50mL×1瓶，-20℃保存。

試劑二：液體10mL×1瓶，-20℃保存。

試劑三：液體1mL×1瓶，-20℃保存。

試劑四：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：液體6 mL×1瓶，4℃保存。

試劑六：粉劑×2瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入5mL蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②將勻漿600g，4℃離心5min。

③棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做）。

⑤步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于NOX活性測定。

血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至600nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）試劑四、試劑五和試劑六于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min。

（2）在1mL石英比色皿中加入40μL樣本、700μL試劑四、100μL試劑五和160μL試劑六，混勻，記錄600nm處20s時吸光值A(chǔ)1和 1min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。

NOX活力單位的計算

1、血清（漿）NOX活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA 

2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL； V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。