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液體活檢：血漿基因（DNA）保存、純化、文庫構(gòu)建和測序
閱讀：4570發(fā)布時間：2018-1-26
液體活檢是指非固體生物組織的取樣和檢測，來源一般是血液和尿液，對象包括血漿游離DNA/RNA、血液循環(huán)腫瘤細胞和外泌體。與傳統(tǒng)的固體活檢相比，液體活檢技術(shù)可以無創(chuàng)取樣，并且能跟蹤檢測基因和生物標志物。目前這種無創(chuàng)技術(shù)應用于癌癥治療和產(chǎn)前篩查等。
液體活檢：無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）
NIPT發(fā)展
NIPT應用
NIPT檢測內(nèi)容
NIPT技術(shù)
NIPT發(fā)展
NIPT發(fā)展迅速，而且它還不是標準醫(yī)療項目，只是一個選擇項目。
NIPT發(fā)展快速得異常，消費者在推進?？赡茉颍和缴缃幻襟w發(fā)展，討論較多。
NIPT應用
NIPT在實際運用中要解決的問題：
市場壓力
專業(yè)指南的快速變化。高風險孕婦和一般孕婦做咨詢用的時間都不一樣。那么獲得的信息也不同。孕婦查出有問題不一定要終止妊娠，還可以多做應對準備。而且做繼續(xù)懷孕決定的比例達到了40%。
NIPS在產(chǎn)前檢測中的準確定位。一開始定位是高危產(chǎn)婦，之后不是高危產(chǎn)婦也對NIPT有興趣。中等風險妊娠群體的NIPT檢測，還會再上升。
NIPT的檢測
NIPT的檢測還不是準確。
低風險用戶越多，PPV值越低。
生物學原因?qū)е碌哪阁w的miccroduplications也會影響檢測結(jié)果。
NIPT和標準產(chǎn)前檢測項目的比較
標準產(chǎn)前檢測項目：血清生化檢測和nuchal translucency超聲波檢查。
NIPT在在某些檢測方面的錯誤率格外低，比如cfDNA陽性預測方面比標準項目做得好。
NIPT的可選項目:性染色體
常規(guī)染色體非整倍體異常項目：21- 三 體 綜 合 征（trisomy 21，T21）、18-三體綜合征（trisomy 18，T18）和 13-三體綜合征（trisomy 13，T13）。
檢測可選項目：性染色體等。NIPT能比超聲波更早知道是否有性別染色體異常。
NIPT技術(shù)
美國NIPS的四個公司：4種技術(shù)。檢測錯誤率差別較大。
Illumina：WGS 全基因組測序
Sequenom：WGS 全基因組測序
Ariosa Diagnostics：targeted approach on a microarray 微陣列靶向方法
Natera：targeted sequencing for SNP 靶向測序檢測單基因
液體活檢：腫瘤CTC和ctDNA
原發(fā)腫瘤（乳房、結(jié)腸、肺、前列腺癌）在形成生長早期，會釋放細胞進入血液循環(huán)。通過各種技術(shù)可以富集檢測這些循環(huán)腫瘤細胞的物理和生物性質(zhì)。
循環(huán)腫瘤細胞，Circulating Tumor cell，簡稱CTC。CTC釋放點：原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤。
CTC死亡后還會釋放出循環(huán)腫瘤DNA，Circulating Tumor DNA，簡稱ctDNA。
CTCs和ctDNA的分析是液體活檢診斷的基石。
CTC和ctDNA的臨床應用
腫瘤檢測 CTCs和ctDNA應用腫瘤的早期檢測很受關(guān)注，面臨的挑戰(zhàn)是目前分析的特定性和敏感度。
預后評估 多種腫瘤已經(jīng)實現(xiàn)預后評估，尤其是乳癌。
指導系統(tǒng)治療
病人亞群分類（stratification）。
CTC研究進展
CTC研究是很活躍的領(lǐng)域，截止2015年12月發(fā)表在PubMed的文獻有17000篇。隨著循環(huán)游離腫瘤DNA分析的發(fā)展，zui近才開始使用“液體活檢”這個條目。分子水平的靈敏分析方便研究者從血漿中篩選特定腫瘤突變的ctDNA，因此ctDNA和CTC成為富有競爭力的生物標志物。
液體活檢血漿DNA保存、純化、文庫構(gòu)建和測序產(chǎn)品（高通量測序法）
血液標本采集、運輸、保存
血漿游離DNA提取純化
血漿游離DNA基因文庫構(gòu)建
文庫產(chǎn)物純化
基因測序
外周血游離DNA標本采集、運輸、保存
外周血血漿游離DNA采集：EDTA 抗凝管或者 Streck Cell-Free DNA BCT 管
Streck Cell-Free DNA BCT® 血漿游離DNA采血管
產(chǎn)品英文名稱：Streck Cell-Free DNA BCT® BLOOD COLLECTION TUBE
產(chǎn)品中文名稱：Streck BCT® 血漿游離DNA采血管
Streck 血漿游離DNA采血管是一種直接提取的全血收集管，用于收集、運輸和儲存血液樣本。Streck 血漿游離DNA采血管內(nèi)含防腐劑，它能穩(wěn)定有核血細胞，防止細胞基因組DNA的釋放，保護血漿游離循環(huán)DNA和循環(huán)腫瘤細胞（CTC）。
230253是218962的升級版，是Streck公司新推將玻璃和塑料的*性能融合在一起的Fusion2TM混合塑料管。
品牌 | 貨號 | 產(chǎn)品描述 | 包裝 |
Streck | 218962 | Cell-Free DNA BCT® BLOOD COLLECTION TUBE Cell-Free DNA BCT®血漿游離DNA采血管 | 100管/盒 |
Streck | 230253 | Cell-Free DNA BCT® BLOOD COLLECTION TUBE Cell-Free DNA BCT®血漿游離DNA采血管（混合塑料） | 100管/盒 |
EDTA抗凝管參見BD真空采血管分類 血清 血漿 單個核細胞 RNA 肝素 EDTA
血漿游離DNA提取純化
磁珠法或離心柱法
離心柱法產(chǎn)品：
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 循環(huán)核酸純化試劑盒
貨號： 55114 品牌：Qiagen
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50)
For 50 preps: QIAamp Mini Columns, Tube Extenders (20 ml), QIAGEN Proteinase K, Carrier RNA, Buffers, VacConnectors, and Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml)
樣品處理量：5mL
洗脫體積：20-150μL
可以洗去PCR抑制物，如：二價陽離子和蛋白
血漿游離DNA文庫構(gòu)建
ThruPLEX® Plasma-seq Kit血漿游離DNA文庫構(gòu)建試劑
ThruPLEX® Plasma-seq基于ThruPLEX技術(shù)，并用于血漿來源cfDNA高品質(zhì)NGS文庫構(gòu)建。該試劑專門針對cfDNA進行優(yōu)化，在保持樣本GC代表性的基礎上，提升了文庫的信息容量。文庫構(gòu)建后可用于CNV分析、全基因組測序分析或是采用一些panel針對目標區(qū)域進行捕獲富集后的DNA分析,如Agilent SureSelect® and Roche NimbleGen SeqCap® EZ。
血漿樣品采用ThruPLEX Plasma-seq試劑盒制備文庫，能有更好的靈敏度、更準確的基因變異分析結(jié)果。與其它液態(tài)活檢的樣品一樣，血漿由于其易獲得、價值高的特點，深受研究腫瘤學或者孕婦血漿中胎兒游離DNA科研工作者的重視。
品牌 | Code No. | 包裝量 |
Rubicon | R400490 | 12 Rxns |
Rubicon | R400491 | 48 Rxns |
Rubicon | R400492 | 96 Rxns |
文庫產(chǎn)物純化
Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒
Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒是一種能夠獲得高質(zhì)量DNA產(chǎn)物的純化試劑盒，純化后的核酸純度高，無鹽離子殘留，無需離心或過濾，目前廣泛應用于NGS文庫構(gòu)建。該試劑的應用為產(chǎn)物純化，如：NGS文庫構(gòu)建過程中酶聯(lián)體系的純化、PCR產(chǎn)物純化等。既可以手工操作，也可以使用自動化工作平臺以96孔或384孔板的形式完成。
品牌 | 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
BeckMan | A63882 | Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒 | 450 mL |
基因測序
參考文獻
1.吳一龍，等. 液體活檢:規(guī)范與同行.循證醫(yī)學，2016年04期，P193-197.
2.Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy,
Catherine Alix-Panabières,Cancer Discov;6(5); 479–91. ©2016 AACR Published OnlineFirst March 11, 2016; DOI: 10.1158/2159-8290.CD-15-1483.
Streck 218962（現(xiàn)貨）,230253 Cell-Free DNA BCT采血管及更多液體活檢產(chǎn)品歡迎您咨詢華雅再生醫(yī)學旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司 ：1500 1904 520。紅榮微再-客服: 2395557778 經(jīng)銷商專員。紅榮微再以“傳遞科學價值，服務科學研究”為宗旨，主營干細胞、醫(yī)療、細胞治療、器官再生四大板塊的產(chǎn)品。
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