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RetroNectin 逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和T細(xì)胞擴(kuò)增方法
閱讀：9977發(fā)布時(shí)間：2018-1-15
RetroNectin逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)操作流程
RetroNectin技術(shù)可以顯著提高逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染效率，這一發(fā)現(xiàn)克服了向造血干細(xì)胞中導(dǎo)入基因的困難。現(xiàn)在，RetroNectin技術(shù)已成為使用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的常規(guī)選擇，其操作流程大致如下：
1. 注射用水或滅菌蒸餾水充分溶解RetroNectin，調(diào)節(jié)濃度至1mg/ml。
2. 0.22 μm濾膜過(guò)濾RetroNectin溶液，分裝后-20 ℃保存。
3. 用緩沖液將RetroNectin溶液稀釋至20～100 μg/ml。
4. 將RetroNectin稀釋液加入24孔板，每孔0.5 ml (建議用PBS緩沖液稀釋RetroNectin后包被Non-Tissue Cluture Treated plate。
5. 室溫放置4小時(shí)或4 ℃，避光，過(guò)夜。
6. 吸出RetroNectin溶液，每孔加入PBS終止液0.5 ml。
7. 室溫放置30分鐘。
8. 加入適量PBS清洗孔板。
9. 吸出清洗液，得到RetroNectin包被的孔板 (如果暫不使用，可以在孔中加入適量PBS，用膠膜將平板蓋密封，避免RetroNectin干燥，可于4 ℃保存4周。使用前將PBS吸出) 。
10. 逆轉(zhuǎn)錄病毒保存液 (-80 ℃) 于37 ℃水浴融解。
11. 將病毒液加入包被后的24孔板，每孔300 μl。
12. 32 ℃放置4小時(shí)。
13. 吸出病毒保存液。
14. 每孔加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸液400 μl (通常細(xì)胞濃度為1 × 105/ml) 。
RetroNectin刺激T細(xì)胞擴(kuò)增方法
T-cell expansion protocol using RetroNectin reagent, GT-T551 T-cell medium, CultiLife bags, and anti-CD3 mAb.
1. RetroNectin和CD3單克隆抗體包被培養(yǎng)袋。
2. 同時(shí)，來(lái)自PBMC的T細(xì)胞用GT-T551培養(yǎng)基+IL-2+血漿培養(yǎng)。
3. 第4天，T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋，繼續(xù)用GT-T551培養(yǎng)基+IL-2+血漿培養(yǎng)。
4. 第7天，添加更多GT-T551培養(yǎng)基+IL-2。
5. 第10天，分裝兩個(gè)培養(yǎng)袋，添加更多GT-T551培養(yǎng)基+IL-2。
RetroNectin® 重組人纖維蛋白片段
RetroNectin®是在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組人纖維蛋白片段FN CH-296。 當(dāng)包被在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板表面時(shí)，RetroNectin®能顯著增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。RetroNectin®重組人纖維蛋白片段和CD3單抗共同作用可刺激T細(xì)胞的增殖和分化。
品牌 | 貨號(hào) | 產(chǎn)品描述 | 包裝 |
TAKARA | T100B | RetroNectin® Recombinant Human Fibronectin Fragment 重組人纖維蛋白片段 | 2.5mg |
TAKARA | T100A | 0.5mg | |
TAKARA | T201 | RetroNectin® Recombinant Human Fibronectin Fragment 重組人纖維蛋白片段，GMP級(jí) | 2.5 mg 凍干粉 |
*
品牌 | 貨號(hào) | 產(chǎn)品描述 | 包裝 |
TAKARA | GT-T551 H3 | 淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基 | 1000 ml |
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