心臟瓣膜的發(fā)育始于內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），其中瓣膜內(nèi)皮細胞（VEC）獲得間充質(zhì)標志物并侵入內(nèi)皮下基質(zhì)形成心臟內(nèi)膜墊。EMT后，這些細胞增殖并分化成細胞外基質(zhì)（ECM），產(chǎn)生瓣膜間質(zhì)細胞（VIC）。通過VEC和VIC的精確調(diào)控，wan;quan舒張的心內(nèi)膜墊經(jīng)過ECM重塑并拉長成細長的瓣葉。在此過程中，生長和重塑受到干擾會導致瓣膜畸形，從而導致臨床上相關(guān)的心臟缺陷。這種干擾的遺傳原因已經(jīng)被廣泛研究，但只能解釋不到 20% 的臨床病例。機械應力在調(diào)節(jié)瓣膜發(fā)育中的重要性已得到廣泛認可。振蕩剪切應力 （OSS）促進 EMT，其細胞和分子機制已得到充分了解。相比之下，機械力在臨床上重要的EMT之后的生長和重塑中的作用仍然知之甚少。

流動的血液在瓣膜上產(chǎn)生剪切和靜水應力。剪切應力與 VECs 直接接觸，而靜水應力在瓣膜中引起壓縮力和拉伸力，并可傳遞到 VICs。已在成人組織中鑒定出多種機械敏感信號通路，但它們與瓣膜形態(tài)發(fā)生的關(guān)系尚不清楚。YAP信號是另一種被廣泛研究的機械活性通路，是Hippo 通路的轉(zhuǎn)錄輔因子。已知YAP信號通過促進心肌細胞增殖來調(diào)節(jié)心室發(fā)育。然而，它在 EndMT 后瓣膜形態(tài)發(fā)生中的作用知之甚少。此外，YAP通路是否對不同細胞類型的不同應力做出不同的反應，以及這些機械反應如何協(xié)同調(diào)節(jié)多種細胞類型以實現(xiàn)特定的組織形態(tài)發(fā)生，尚不清楚。

最近，美國康奈爾大學梅尼格生物醫(yī)學工程學院研究組在《eLife》發(fā)表了題為“Shear and hydrostatic stress regulate fetal heart valve remodeling through YAP-mediated mechanotransduction"的文章，探討了剪切和靜水應力調(diào)控瓣膜生長和重塑的機制。該團隊使用體外和離體模型來解耦剪切和靜水應力對瓣膜尺寸和形狀的影響，還研究了YAP介導的機械轉(zhuǎn)導在這些效應中的作用。通過結(jié)合這些模型，詳細闡述了剪切和靜水應力如何調(diào)節(jié)VEC和VIC，以確定瓣膜的合適尺寸和形狀。

YAP表達受時空調(diào)控

實驗首先收集了野生型小鼠不同發(fā)育階段的胚胎心臟，并檢查了心臟瓣膜中的YAP激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在E11.5（胚胎期）時，YAP在流出道（OFT）和房室（AV）緩沖層的間質(zhì)和內(nèi)皮中均有表達。在E14.5時，VIC中YAP激活顯著升高，然后在E17.5時下降。在后期重塑階段，YAP激活的這種降低在房室瓣膜中是顯著的，但在左室瓣膜中不明顯，因為所有瓣膜的發(fā)育并不均勻。在流出側(cè)的VECs中，細胞核YAP表達在后期重塑階段顯著增加。盡管在流入側(cè)的VECs中，細胞質(zhì)YAP表達在所有階段都更強。

此外，還在漢堡-漢密爾頓（Hamburger–Hamilton stages）階段（HH）25、HH30和HH36檢測了雞胚胎心臟中YAP的活性，它遵循相同的時空模式。VICs中的YAP激活在HH30激增，然后在HH36下降。流出側(cè)的VECs具有上調(diào)的核YAP表達，而流入側(cè)VECs的YAP表達主要在細胞質(zhì)中。

進一步檢測YAP轉(zhuǎn)錄活性，以確定YAP激活的上游。與E11.5或HH25緩沖層相比，YAP靶基因THBS1，ANKRD1和PTX3在E14.5和HH31處分別升高了近10倍。這些基因的表達隨后在重塑的后期階段顯著降低。相比之下，LATS1/2（Hippo 通路中YAP的上游）的基因表達在瓣膜生長和重塑過程中幾乎沒有變化。這表明YAP活性在很大程度上獨立于Hippo 通路。

剪切和靜水應力調(diào)節(jié)YAP活性

除了Hippo 通路的協(xié)同效應外，YAP也是機械轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵介質(zhì)。事實上，YAP的時空激活與機械環(huán)境的變化相關(guān)。在瓣膜重塑過程中，單向剪切應力（USS）在瓣膜的流入表面上產(chǎn)生，其中YAP很少在VECs的核中表達（圖1 A）。另一方面，振蕩剪切應力（OSS）在流出表面上發(fā)生，其中核YAP定位在VECs。VICs中的YAP激活也與靜水應力相關(guān)。應力在瓣膜jian;duan產(chǎn)生壓應力（CS），其中核 YAP 定位在 VICs（圖1 B）。盡管拉伸應力（TS）是在伸長區(qū)域產(chǎn)生的，但YAP在VIC核中不存在。

為了研究剪切應力對VECs中YAP活性的影響，實驗將USS和OSS直接應用于VECs，發(fā)現(xiàn)低OSS（2 dyn/cm2）促進 VEC 中的 YAP 核易位（圖1 C、E），而高USS （20 dyn/cm2）抑制了細胞質(zhì)中的YAP。

為了研究靜水應力對VICs中YAP活化的影響，實驗使用具有不同滲透壓的培養(yǎng)基來模擬CS和TS。在不同負荷條件下培養(yǎng)HH27 AV緩沖層外植體24 h，發(fā)現(xiàn)梯形緩沖層呈球形（圖1 D）。TS加載后緩沖層顯著壓縮，VICs中YAP活化顯著低于CS加載的VICs（圖1 F）。

圖1   剪切應力和靜水應力調(diào)節(jié)YAP活性。

YAP的缺失限制了細胞增殖并促進瓣膜成形

為了研究YAP在瓣膜生長和重塑中的功能，在CS（促生長）和U（卸載）條件下添加了YAP的藥理學抑制劑維替泊芬（VP）。抑制YAP減小了緩沖層的大小。與在CS下培養(yǎng)的緩沖層的球形狀相反，在具有VP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的瓣膜保持其梯形形狀。進一步的研究表明，YAP的缺失顯著抑制了VIC的增殖。此外，YAP抑制顯著增強了VECs之間VE-鈣粘蛋白的表達。緩沖層通常只有一層內(nèi)皮，但YAP抑制的瓣膜顯示五層或更多層內(nèi)皮。

激活YAP促進細胞增殖并抑制瓣膜伸長

為了研究YAP的功能獲得性，在TS（促壓縮）和U條件下添加一個YAP 轉(zhuǎn)錄活性的特異激活劑PY-60。YAP激活扭轉(zhuǎn)了瓣膜在TS和U條件下的壓縮趨勢，并推動了瓣膜尺寸的增長（圖2 A、B）。所有瓣膜都呈球形，無論它們是生長還是被壓縮。pHH3染色顯示，無論加載條件如何，YAP活化顯著提高了VIC增殖（圖2 C、G）。VE-鈣粘蛋白在YAP活化的內(nèi)皮中的表達明顯弱于YAP被抑制的內(nèi)皮（圖2 D）。

圖2   激活YAP可促進細胞增殖，抑制瓣膜伸長。

抑制YAP促進體內(nèi)樣剛度增加

為了評估YAP在瓣膜剛度中的作用，實驗測量了VP或PY-60處理的緩沖層外植體的應變能量密度。這種方法已被應用測量不同發(fā)育階段雛雞胚胎瓣膜的機械性能。結(jié)果表明，從HH25到HH34，瓣膜剛度幾乎呈線性增長，幾乎每24小時翻一番。在這項研究中發(fā)現(xiàn)，抑制YAP在24小時培養(yǎng)期間也給出了類似的硬度增加（圖2 H）。盡管YAP激活和抑制都增加了瓣膜剛度，但激活YAP后瓣膜的剛度僅為抑制YAP時的一半。

體內(nèi)機械操作導致瓣膜缺損和YAP失調(diào)

為了操縱體內(nèi)的機械力，實驗在AV緩沖層生長的早期階段（HH24）進行了左心房結(jié)扎（LAL）。LAL限制了左心室的血流，導致左室瓣膜的血流動力學應力和剪切應力降低，但右室瓣膜的力增加。結(jié)果，LAL瓣膜和心臟（圖3 A）的尺寸小于對照瓣膜和心臟（圖3 B）。具體而言，LAL導致左房室間隔瓣發(fā)育不全且呈球形，而右房室間隔瓣過度發(fā)育和拉長。這與正常的瓣膜發(fā)育相反，在正常瓣膜發(fā)育期間，左房室瓣膜的尺寸要大得多，并且更細長（圖3 C）。對照組中YAP激活在左右AV中均較高，而LAL導致不平衡的YAP激活：右室AV YAP激活高，而左室AV激活顯著降低（圖3 D）。

圖3   中斷的生物力學改變了YAP的激活并導致體內(nèi)瓣膜缺損。

圖4   剪切應力和靜水應力的局部協(xié)作可以通過YAP信號引導復雜的形態(tài)發(fā)生。

（A）房室管或 OFT 中對稱心內(nèi)膜墊的模型。（B）模型的橫截面顯示流動的血液在緩沖層上產(chǎn)生靜水應力和剪切應力。（C）振蕩剪切應力（OSS）和壓應力（CS）分別促進了VEC和VIC的YAP核易位。單向剪切應力（USS）抑制了YAP核易位。CS通過刺激間充質(zhì)細胞的增殖來促進緩沖層生長。（D）剪切應力通過調(diào)節(jié)VECs之間的細胞-細胞粘附來驅(qū)動緩沖層重塑為小葉結(jié)構(gòu)。（E）拉伸應力（TS）抑制YAP核易位與USS共同作用，形成緊湊而細長的形態(tài)。

總之，該研究表明，剪切應力和靜水應力的時空協(xié)調(diào)機械轉(zhuǎn)導是瓣膜生長和重塑所必需的。剪切應力和靜水應力可以通過YAP通路調(diào)節(jié)VEC張力和VIC增殖，從而決定瓣膜的尺寸和形狀。功能失調(diào)的YAP信號可能導致瓣膜畸形，但不正確的局部機械信號傳導會帶來更重要的畸形風險，即使YAP信號功能齊全且沒有基因突變。其中所提出的機械生物學系統(tǒng)還可以通過影響力或在特定階段靶向YAP通路來控制瓣膜生長和改變瓣膜形狀。

參考文獻：Wang M, Lin BY, Sun S, Dai C, Long F, Butcher JT. Shear and hydrostatic stress regulate fetal heart valve remodeling through YAP-mediated mechanotransduction. Elife. 2023 Apr 20;12:e83209. doi: 10.7554/eLife.83209. PMID: 37078699; PMCID: PMC10162797.

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