microRNA 是一種含有約 22 個核苷酸的小型非編碼 RNA 鏈，它們能通過與靶 mRNA 的3′UTR（非編碼區(qū)）*互補導(dǎo)致 mRNA 降解。已知MicroRNAs（miRNA）廣泛參與心血管疾病發(fā)病機制中的基因調(diào)控，包括心肌細胞肥大、纖維化和凋亡。miRNA 表達譜已在心臟中鑒定出 miRNA-499（miR-499）、miRNA-208a（miR-208a），這些 miRNAs 在應(yīng)對應(yīng)激的心肌細胞肥大和纖維化中起重要作用。

與其他 RNAs 一樣，miRNA 也是轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。因此，一種 miRNA 可以調(diào)節(jié)另一種 miRNA 的表達。 miR-499 對 miR-208a 的調(diào)節(jié)增加了 miR-499 調(diào)節(jié)的心臟 microRNA 的數(shù)量。

B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）在人體中由BCL2基因編碼，是 Bcl-2 調(diào)節(jié)蛋白家族的創(chuàng)始成員，也是線粒體細胞死亡途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)成分。Bcl-2 位于線粒體外膜，在促進細胞存活和抑制促凋亡蛋白方面發(fā)揮重要作用。

病理條件下心房成纖維細胞的增殖在心房電重構(gòu)和心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中起重要作用。研究報道，心房心臟成纖維細胞通過間隙連接施加電緊張，影響心肌細胞的電耦合性形式并引起心房顫動。對培養(yǎng)細胞進行與體內(nèi)動態(tài)拉伸超負荷相當?shù)捏w外各種水平的循環(huán)機械拉伸已得到很好的研究，包括研究心肌細胞、血管平滑肌細胞和新生大鼠心肌細胞中基因表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制的研究。然而，機械拉伸對心房心臟成纖維細胞的影響鮮有報道。

拉伸的心房心臟成纖維細胞和血流動力學(xué)超負荷心臟中 miR-499、miR-208a 和 Bcl-2 之間的關(guān)系尚未明確。此外，miR-499 和 miR-208a 誘導(dǎo)拉伸的心房心臟成纖維細胞凋亡的分子調(diào)控機制仍然知之甚少。因此，中國臺灣天主教輔仁大學(xué)醫(yī)學(xué)院、新光醫(yī)院心臟內(nèi)科及急診科的一項研究旨在探討調(diào)節(jié) miR-499 和 miR-208a 對拉伸的心房成纖維細胞和容量超負荷誘發(fā)心力衰竭大鼠模型中 Bcl-2 蛋白表達的分子機制。

機械拉伸抑制人心臟成纖維細胞-成人心房中的 miR-208a，但增強 miR-499 和 Bcl-2 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達

實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）用于測量 miR-208a 和 miR-499 水平，以檢查機械拉伸對人心臟成纖維細胞-成人心房（HCF-aa）中 miR-208a 和 miR-499 的影響。1 Hz，20% 伸長率的機械拉伸持續(xù) 0.5-2 小時導(dǎo)致 miR-208a 表達顯著高于對照細胞，然而，拉伸 4-8 小時將 miR-208a 的表達恢復(fù)到控制水平（圖1 A）。機械拉伸 2-8 小時導(dǎo)致 miR-499 顯著升高（圖1 B）。此外，拉伸 1 h 時 Bcl-2 mRNA 的表達顯著低于對照，機械拉伸 2-8 h 時 Bcl-2 mRNA 和蛋白質(zhì)上調(diào)（圖1 C-E）。

圖1   機械拉伸抑制了人心肌成纖維細胞-成人心房（HCF-aa）中的miR-208a，但增強了miR-499，Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白的表達。

MiR-499 降低拉伸的 HCF-aa 中 pri-miR-208a 熒光素酶活性

實驗發(fā)現(xiàn)，位于 pri-miR-208a 基因位點下游 57bp的人類 pri-miR-208a ，具有 miR-499-5p 的結(jié)合位點。機械拉伸 1 小時顯著增加 HCF-aa 中的 pri-miR-208a 熒光素酶活性。然而，用 miR-499 預(yù)處理抑制了拉伸的 HCF-aa 中 pri-miR-208a 熒光素酶活性的表達。pri-miR-208a 上 miR-499 結(jié)合位點的突變通過 1 小時的拉伸消除了對 pri-miR-208a 熒光素酶活性的抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明，pri-miR-208a 是 miR-499 的靶標。

機械拉伸通過 miR-208a 抑制 Bcl-2-3'UTR 熒光素酶活性

Bcl-2-3'UTR 包含 miR-208a 結(jié)合位點，而突變體 Bcl-2-3'UTR 具有 miR-208a 結(jié)合位點的突變。熒光素酶報告基因分析顯示，機械拉伸 1 小時可抑制 Bcl-2-3'UTR 熒光素酶活性。然而，這種效應(yīng)被 Bcl-2-3'UTR 中 miR-208a 結(jié)合位點的突變抑制。添加 antagomir-208a 增強了拉伸的 HCF-aa 中的 Bcl-2-3'UTR 熒光素酶活性，但對突變體 Bcl-2-3'UTR 沒有影響。添加突變型 miR-208a 對 Bcl-2-3'UTR 熒光素酶活性沒有影響。這些結(jié)果表明，Bcl-2-3'UTR 中的 miR-208a 結(jié)合位點對于機械拉伸誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要。

MiR-499 抑制拉伸的 HCF-aa 中 miR-208a 的表達

與單獨拉伸相比，miR-499 過表達顯著抑制了機械拉伸 1 小時的 HCF-aa 中 miR-208a 的表達（圖2 A）。然而，添加突變型 miR-499 或 antagomir-499 并沒有抑制 miR-208a 的表達。添加 antagomir-499 通過 4 小時的拉伸減弱了 miR-208a 的下調(diào)（圖2 B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR-208a 表達的下調(diào)可能是由于機械拉伸過程中 miR-499 的上調(diào)所致。

圖2   miR‐499通過miR-208a影響Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)在拉伸的人心肌成纖維細胞-成人心房（HCF-aa）中的表達。

機械拉伸通過 miR-208a 影響 Bcl-2 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達

與單獨拉伸相比，添加 miR-208a 顯著抑制機械拉伸 4 h 誘導(dǎo)的 Bcl-2 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達（圖2 C-E），而添加突變型 miR-208a 或 antagomir-208a 對這種 Bcl-2 表達沒有影響。與單獨拉伸相比，Bcl-2小干擾RNA（siRNA）抑制機械拉伸4小時誘導(dǎo)的Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達，而添加亂序siRNA對這種抑制作用沒有影響。用野生型 miR-208a 預(yù)處理對沒有拉伸的 HCF-aa 中的 Bcl-2 表達沒有影響。

免疫組織化學(xué)染色證實機械拉伸 4 小時后 HCF-aa 中 Bcl-2 表達增加（圖3 A、B）。添加野生型 miR-208a 抑制了 Bcl-2 表達，而用突變型 miR-208a 或 antagomir-208a 預(yù)處理沒有影響（圖3 C–E）。野生型 miR-208a 對沒有拉伸的 HCF-aa 中的 Bcl-2 表達沒有影響（圖3 F）。添加 Bcl-2 siRNA 在拉伸 4 小時后抑制 HCF-aa 中 Bcl-2 的表達，而添加亂序 siRNA 對這種抑制沒有影響（圖3 G、H）。這些結(jié)果表明，機械拉伸 4 小時會通過 miR-208a 影響 Bcl-2 的表達。

圖3   免疫組織化學(xué)染色證實了Bcl-2在人心肌成纖維細胞-成人心房（HCF-aa）中的表達。

圖4   熒光素異硫氰酸酯-膜聯(lián)蛋白V在各種條件下對人心肌成纖維細胞-成人心房（HCF-aa）的分析。

MiR-499 通過 miR-208a 調(diào)節(jié) AV 分流大鼠心肌 Bcl-2 的表達

在主動脈腔靜脈（AV）分流的成年大鼠中誘導(dǎo)容量超負荷，研究了 miR-499 和 miR-208a 對體內(nèi) Bcl-2 表達的影響。AV 分流導(dǎo)致心肌 miR-208a 表達從 3 天到 5 天顯著增加，但從 7 天到 14 天下降（圖5 A）。此外，miR-499 的表達從 7 天增加到 14 天（圖5 B）。野生型 miR-499 過表達在 5 天時顯著降低了 miR-208a 的表達，但添加突變型 miR-499 和 antagomir-499 對 miR-208a 的表達沒有影響（圖5 C）。

與假手術(shù)大鼠相比，AV 分流大鼠心肌 Bcl-2 mRNA 和蛋白表達在 7 至 14 天顯著被誘導(dǎo)（圖5 D–F）。進行 AV 分流 14 天后，大鼠心肌 Bcl-2 mRNA 和蛋白表達顯著增加（圖5 G–I）。用 miR-208a 預(yù)處理顯著抑制了這種增加，而添加突變型 miR-208a 和 antagomir-208a 沒有影響。與 AV 分流大鼠相比，用 Bcl-2 siRNA 預(yù)處理可抑制心肌 Bcl-2 mRNA 和蛋白的表達，而添加亂序 siRNA 對這種抑制沒有影響。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR-208a 的表達可以受 miR-499 的調(diào)節(jié)，并且可以調(diào)節(jié)容量超負荷大鼠心臟中 Bcl-2 的表達。

圖5   miR‐499通過miR‐208a在具有AV分流的大鼠中調(diào)節(jié)心肌Bcl-2表達。

圖6   miR‐208a通路通過人心肌成纖維細胞-成人心房（HCF-aa）中miR-499介導(dǎo)了Bcl-2表達。miR-499的關(guān)鍵作用可能為心血管疾病的microRNA靶向治療帶來潛在的應(yīng)用前景。

總之，研究發(fā)現(xiàn) miR-208a 是 miR-499 的直接靶標，并且 miR-208a 的抑制緩解了機械拉伸的 HCF-aa 中 Bcl-2 的抑制（圖6），還觀察到 antagomir-208a 過表達增強了容量超負荷誘導(dǎo)的心力衰竭模型中 Bcl-2 的表達。microRNA 介導(dǎo)的 microRNA 調(diào)控的結(jié)果是 microRNA 靶向的心血管治療的潛在新應(yīng)用。

參考文獻：Chua SK, Wang BW, Yu YJ, Fang WJ, Lin CM, Shyu KG. Cyclic stretching boosts microRNA-499 to regulate Bcl-2 via microRNA-208a in atrial fibroblasts. J Cell Mol Med. 2021 Mar;25(6):3113-3123. doi: 10.1111/jcmm.16373. Epub 2021 Feb 18. PMID: 33605072; PMCID: PMC7957261.

小編旨在分享、學(xué)習、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進展。如有侵權(quán)或引文不當請聯(lián)系小編修正。

微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用！