酶切反應(yīng)注意事項(xiàng)

限制酶價(jià)格昂貴，操作時(shí)應(yīng)注意下列原則

1. 許多購(gòu)得限制酶為濃縮液，通常1ul（約10單位）酶液足以在1小時(shí)內(nèi)切割10ugDNA。當(dāng)需要從觀眾取出少量酶液時(shí)，可用一次性移液器吸頭稍稍接觸頁(yè)面，這樣可取出少至0.1ul的酶液。另一種方法是將一根孔徑很小的塑料管（Icm長(zhǎng)）套在1ul的微量注射器上，然后吸取酶液。濃縮的酶液可在使用前1X反應(yīng)緩沖液稀釋，但絕不能用水稀釋，以免變性失活。
2. 限制酶在含50%甘油的緩沖液中，-20℃下可穩(wěn)定保存。在家酶反應(yīng)之前，反應(yīng)管中應(yīng)預(yù)先加入除了酶以外的所有其他試劑。從冰箱中取出酶后，立即放于冰上。每次取酶都必須使用無(wú)菌的新吸頭，如果酶被DNA或其他酶污染，則費(fèi)錢(qián)耗時(shí)，影響工作。不鞥呢讓酶在冰箱外放置過(guò)久，更不能讓其溫度大于0℃，應(yīng)盡快操作，用完后立即將酶放回冰箱。
3. 酶應(yīng)分裝成小份盡量避免反復(fù)凍融。
4. 反應(yīng)中盡肯能少加水，使反應(yīng)體積保持zui小，但必須保證酶液的體積不超過(guò)總反應(yīng)體積的10%，否則酶液中的甘油會(huì)抑制酶的活性。
5. 通常延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可以減少酶的用量，當(dāng)切割大量DNA時(shí)，這樣做比較節(jié)約。
6. 當(dāng)需在許多管DNA樣品中用同一種酶時(shí)，應(yīng)計(jì)算所需酶的總量（包括略微增加一點(diǎn)酶量以彌補(bǔ)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的損失），然后取出酶，用適當(dāng)?shù)?X酶反應(yīng)緩沖液稀釋，再將酶稀釋液分別加至各個(gè)反應(yīng)管中。如果DNA需要用兩種或更多種酶切割，而某一種緩沖液對(duì)兩種酶都很適合，則反映可同時(shí)進(jìn)行。如果需要不同的緩沖液，則有兩種辦法①采用下表中的三種緩沖液，先用適合低離子濃度緩沖液的酶切割DNA，然后加入適量的NaCI調(diào)節(jié)緩沖液中的鹽濃度并加入第二種酶。②使用表二中的適合于所有限制酶KGB（谷氨酸鉀緩沖液）通過(guò)緩沖液
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