主要用途

    組織基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過熒光探針MCA供體和DAP/DNP受體雙重標(biāo)記的多肽底物PChaGNvaHA，受到MMP13蛋白酶的水解，解離抑制基團(tuán)，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，即采用熒光法來測(cè)定樣品中酶活性而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或*純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶13的特異活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）         毫升

裂解液（Reagent B）         毫升

緩沖液（Reagent C）         毫升

底物液（Reagent D）         微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）              微升

產(chǎn)品說明書             1份

保存方式

保存底物液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重500毫克

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （選擇步驟）抽去清理液

5． 移入到一個(gè)液氮凍存管

6． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜

7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

9． 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 

10． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11． 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/span>）

12． 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

13． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管

14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

15． 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如組織裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長330nm，散發(fā)波長400nm，間隔5分鐘，讀數(shù)6次（共30分鐘）

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

1． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管

2． 分別加入xx微升緩沖液（Reagent C）到1至5號(hào)管

3． 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻

4． 小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻

5． 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻

6． 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻

7． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

四、熒光測(cè)定

1． 在黑色96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品活性

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里

3． 分別加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品（20微克純化酶或100微克組織裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）

6． 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板

7． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）

8． 標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)際熒光讀數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)樣品值—背景對(duì)照值

9． 待測(cè)樣品實(shí)際熒光讀數(shù)：5分鐘熒光讀數(shù)—背景對(duì)照熒光讀數(shù)

10． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位RFU；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

11． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

五、計(jì)算樣品活性

 注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需1次

4． 樣品須澄清，至關(guān)重要

5． 樣品準(zhǔn)備要點(diǎn)如下：

a) 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價(jià)陽離子鰲和劑

b) 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）

c) 如果樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用膠原酶潛酶活化劑（APMA）－GMS12197）

6． 如果用戶沒有特定的濾波器，可以使用激發(fā)波長320至340nm之間的任一波長，散發(fā)波長390至420nm之間的任一波長

7． 測(cè)定值由低到高變化；通常測(cè)定持續(xù)5分鐘，如果酶活性過低，可以持續(xù)測(cè)讀30分鐘

8． 熒光讀數(shù)增加，表明具有酶活性

9． 待測(cè)樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為20微克/20微升；待測(cè)樣本為總蛋白，其蛋白濃度為100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

10． 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

11． 可以使用基質(zhì)金屬蛋白酶13抑制劑CL-82198作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

12． 基質(zhì)金屬蛋白酶13活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1納摩爾的多肽底物PChaGNvaHA

13． 本公司提供系列基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

使用承諾

秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾"的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請(qǐng)立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。