一、產(chǎn)品說(shuō)明

DNA 在自由基(如·OH)的攻擊下容易發(fā)生損傷,即脫氧戊糖遭到破環(huán),磷酸二脂鍵的斷裂,堿基的破環(huán)或脫落,便可進(jìn)一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂。將細(xì)胞固定于低熔點(diǎn)瓊脂糖中,取少量細(xì)胞涂在載玻片上,用堿高鹽溶液破壞細(xì)胞膜,再用堿溶液使 DNA 分子解旋。將載玻片置于電泳液中,在電場(chǎng)的作用下,DNA 分子向陽(yáng)極移動(dòng)。如果 DNA 損傷嚴(yán)重,碎片多,則電泳速度快。未受損傷的 DNA 大分子則由于細(xì)胞膜的阻隔,滯留在原處。用 PI 染色或銀染,可觀(guān)察到DNA 受損的細(xì)胞形同彗星現(xiàn)象,作定性分析。也可用相關(guān)的軟件作定量分析。

第 3 層凝膠的制備：第 2 層LMA 凝固后,在室溫下小心移去蓋玻片,滴加預(yù)熱 37℃的 75μL 的 0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA,如上蓋上蓋玻片 4℃下凝固(第三層覆蓋第二層周?chē)?0.5mm,增加凝膠化作用時(shí)間至 30min, 高濕度環(huán)境)。

3、細(xì)胞裂解

移去蓋玻片,將玻片置于平皿中,倒入預(yù)冷的 Lysis Bufffer(使用前每 9mL 加入 1mL 的DMSO),4℃ 裂解 1～2h,取出載玻片用PBS 漂洗。

4、DNA 堿解旋

將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液(用戶(hù)自備 1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH),約覆過(guò)載玻片膠面 0.25cm 左右,室溫放置 20～60min,以便使DNA 在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段,使DNA 斷鏈在電場(chǎng)中易于遷移。

5、單細(xì)胞電泳

在電壓 25V,電泳 20～30min,電壓、電流可用改變緩沖液面高低來(lái)調(diào)節(jié)。6、中和與染色

電泳后將載玻片置于平皿內(nèi)。加入 0.4mmol/L Tris-HCl(ph7.5)緩沖液,將載玻片沒(méi)入,4℃中和三次,每次 10min,棄去 Tris-HCl 緩沖液,每載玻片加 20μL 的 PI 染液或 EB 染液,蓋上蓋玻片,避光染色10min。

7、觀(guān)察、拍照和分析

熒光顯微鏡 515～560nm 波長(zhǎng)的激發(fā)光、PI 染色的DNA 圖象呈紅色,EB 染色的DNA 圖象呈桔紅色, 可清楚地觀(guān)察到核DNA 和遷移的DNA(即慧星尾)。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇 100 個(gè)細(xì)胞,測(cè)定核DNA 直徑和DNA 遷移的長(zhǎng)度,可并用相應(yīng)的軟件分析。