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GST融合蛋白純化磁珠 技術(shù)問答
GST融合蛋白純化篇
1.如何純化GST融合蛋白？
2.可純化蛋白種類
3.磁珠掛不上目的蛋白
以下的處理方案的前提是樣本里面有目的蛋白，如果是包涵體需要變性。
可能一：結(jié)合條件不對(duì)
理想的結(jié)合條件為pH 6.5-8.0，純化之前確認(rèn)磁珠是否采用緩沖液平衡以及蛋白樣本的pH值，低于pH6.5或高于pH8時(shí)，融合蛋白與磁珠結(jié)合不充分導(dǎo)致結(jié)合效率低。
可能二：樣本中目的蛋白的濃度偏低
目的蛋白的濃度過低，會(huì)嚴(yán)重影響磁珠與蛋白的結(jié)合。
兩種方法可供選擇：
a)濃縮蛋白樣本；b)增加磁珠的濃度
可能三：檢查目的蛋白是否聚集沉淀
在細(xì)胞裂解前加入DTT，在緩沖液中也加入DTT 。1-20mM的DTT 會(huì)顯著增加某些GST融合蛋白的結(jié)合。
可能四：判斷是否是因?yàn)镚ST失活
過度超聲會(huì)破壞標(biāo)簽蛋白而減少其與磁珠的結(jié)合。減少超聲破碎的時(shí)間和強(qiáng)度。
可能五：標(biāo)簽蛋白可能改變了GST 構(gòu)相
降低結(jié)合的溫度來改善結(jié)果。
4.目的蛋白在磁珠上，洗脫不下來
*步：判斷是否結(jié)合
取Mag beads加loading buffe煮沸，再跑page電泳。
如果確認(rèn)有蛋白，且載量還很高，那么極有可能是形成了過蛋白沉積。
太多的蛋白沉積在磁珠孔內(nèi)，無法洗脫。建議將目的蛋白樣本稀釋，少量純化。
第二步：調(diào)節(jié)洗脫條件
洗脫緩沖液pH，酸性的都洗不下蛋白。盡量將洗脫液的pH值調(diào)到8.0。
5.洗脫樣本里面有雜蛋白
可能一：非特異性吸附
提高平衡緩沖液中的鹽濃度可以降低因?yàn)殡x子作用帶來的非特異吸附。
在平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton可以避免因?yàn)槭杷嗷プ饔脤?dǎo)致非特異吸附，這些措施都可以電泳的雜帶明顯減少。
可能二：26KD的GST條帶
GST融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)很容易表達(dá)到GST部分就終止，所以26KD左右的雜帶是很常見的，那可以選擇用不同濃度的還原谷胱甘肽去做階段洗脫，如果還是分不開，那也許就得選擇離子交換或者凝膠過濾等別的分離手段。
可能三：蛋白降解
如果用上述方法還是雜帶多，那就地回頭去看看破碎的條件是不是太劇烈或者溫度控制不好導(dǎo)致蛋白短裂或者分解導(dǎo)致一些蛋白片段帶標(biāo)簽，或者因?yàn)闃悠烽L(zhǎng)時(shí)間保存導(dǎo)致水解等
可能四：蛋白相互作用
蛋白相互作用形成聚合體，導(dǎo)致雜帶增加，而由于疏水相互作用或者因?yàn)殡x子作用可以通過添加表面活性劑或者增加離子強(qiáng)度得到改善，對(duì)于因?yàn)樾纬删酆象w的可以在緩沖液和樣品中加1-2mM巰基乙醇避免。