分光光度法米醋總酸量及氨基酸氮含量測(cè)定

關(guān)鍵詞：分光光度法；米醋；氨基酸氮；美析儀器; V-1300

米醋的主要成分為醋酸，此外還有少量的其他弱酸。要測(cè)定其總酸度，我們可以用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，用酚酞作指示劑，從而測(cè)得其總酸度。

對(duì)于氨基酸氮含量的測(cè)定，主要有4種方法：

（1）我們先是使-NH₂與甲醛結(jié)合，其堿性消失，破壞內(nèi)鹽的存在，就可以用堿來(lái)滴定-COOH基，以間接方法測(cè)定氨基酸的量。由于米醋中氨基酸的含量比較少，所以測(cè)出的結(jié)果準(zhǔn)確度較低，選擇性較差，滴定終點(diǎn)不易掌握，結(jié)果不夠理想，而且甲醛會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。

（2）把氨基酸中的-NH₂轉(zhuǎn)化成NH₄⁺，因NH₄⁺的酸性太弱，不能用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液直接測(cè)定，所以用甲醛法進(jìn)行測(cè)定NH₄⁺。甲醛與NH作用生成質(zhì)子化(CH₂)₆ N₄H⁺和H⁺反應(yīng)式為：         

（3）氨基酸氮的測(cè)定還可以利用Hantzsh反應(yīng)原理，用乙酰丙酮—甲醛混合溶液作為氨基酸的衍生物，采用吸光度法測(cè)定食醋中氨基酸態(tài)氮的含量。

（4）電位滴定法根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極（或復(fù)合電極）插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用堿液滴定，根據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)。

二、實(shí)驗(yàn)原理：

1、關(guān)于總酸量的測(cè)定

醋酸為有機(jī)弱酸（Ka=1.8×10-5）, 與NaOH反應(yīng)式如下：

        HAc + NaOH = NaAc + H₂O

反應(yīng)產(chǎn)物為強(qiáng)堿弱酸鹽，滴定突躍在堿性范圍內(nèi)，可選用酚酞等堿性范圍變化的指示劑。食用米醋中的主要成分是醋酸，其總酸度用HAc的含量來(lái)表示。

2、關(guān)于食醋中氨基酸含氮量的測(cè)定

用甲醛法測(cè)氨基酸含氮量

氨基酸具有酸、堿兩重性質(zhì)，因?yàn)榘被岷?COOH基顯示酸性，又含有-NH₂基顯示堿性。由于這兩個(gè)基的相互作用，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH₂與甲醛結(jié)合，其堿性消失，破壞內(nèi)鹽的存在，就可用堿來(lái)滴定-COOH基，以間接方法測(cè)定氨基酸的含氮量。用堿*中和-COOH基時(shí)的PH值為8.4~9.2，可用酚酞作為指示劑，NaOH作為滴定劑。

         氨基酸態(tài)氮含量=（N×V×0.014×100%）/W

（N：NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液當(dāng)量濃渡；V：NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的總量(m1)；W：樣品溶液相當(dāng)樣品重量(克)；0.014：氮的毫克當(dāng)量。）

用吸光度法測(cè)氨基酸含氮量

β-二酮與甲醛的混合試劑與α-氨基酸具有非常靈敏的顯色反應(yīng)。根據(jù)Hantzsch反應(yīng)原理，認(rèn)為顯色產(chǎn)物為3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氫化吡啶羰酸衍生物，反應(yīng)式如下：

三、所需儀器、試劑的計(jì)劃用量及配制方法

儀器：

1.臺(tái)秤 2.電子天平 3.錐形瓶  4.鐵架臺(tái)  5.移液管  6.燒杯  7.堿式滴定管    8.容量瓶  9.塑料試劑瓶 10.稱(chēng)量瓶  11.量筒  12.酒精燈   13.V-1300型可見(jiàn)分光光度計(jì)

試劑：

1、NaOH溶液  0.1mol/L 用燒杯在粗天平上稱(chēng)取4g固體NaOH，加入新鮮的或煮沸的除去CO₂的蒸餾水，溶解*后，轉(zhuǎn)入帶橡皮的試劑瓶中，加水稀釋至1L，充分搖勻。

2、酚酞指示劑  2g/L乙醇溶液

3、鄰苯二甲酸氫鉀（KHC₈H₄O₄）基準(zhǔn)物質(zhì)  在100—125℃干燥1h后，置于干燥器中備用。

4、食用醋酸試樣

5、中性甲醛溶液18%(1+1)

6、氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)量105℃干燥2h的分析純硫酸銨0.0472克于100mL容量瓶中，混勻，用水稀釋成1mg/L

7、顯色劑：15mL37%甲醛和7.8 mL乙酰丙酮混合，加水至100 mL

8、緩沖溶液： pH=4.7的NaAc-HAc緩沖溶液，取NaAc83g溶于水加冰醋酸60mL稀釋至1L。

9、百里酚藍(lán)指示劑

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、0.1 mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的標(biāo)定

在稱(chēng)量瓶中以差減法稱(chēng)量KHP3份，每份0.4—0.5g,,分別倒入2—3滴酚酞指示劑，加入40—50mL蒸餾水，待試劑*溶解后，加入2—3滴酚酞指示劑，用待標(biāo)定的NaOH溶液滴定至微紅色并保持半分鐘即為終點(diǎn)，計(jì)算NaOH溶液的濃度和各次標(biāo)定結(jié)果的相對(duì)偏差。

食用米醋中總酸量的測(cè)定

用移液管移取食醋試樣20.00mL于100.0mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋、定容，搖勻。用移液管移取食醋稀釋液20.00mL于250mL錐形瓶中，加入25mL蒸餾水，2滴酚酞指示劑，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由無(wú)色變?yōu)槲⒓t，30s不褪色即為終點(diǎn)，記錄消耗NaOH的體積（平行做3次，相對(duì)平均偏差應(yīng)小于0.2%）。根據(jù)NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和滴定時(shí)消耗的體積（V），可計(jì)算出食醋中總酸量。

3、甲醛溶液的處理

甲醛中常含有微量酸，應(yīng)事先中和。其方法如下：取原瓶裝甲醛上層清液于燒杯中，加水稀釋一倍，加入2～３滴酚酞指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定甲醛溶液至呈現(xiàn)微紅色。

4、食用米醋中氨基酸含氮量測(cè)定

用移液管取1.00ml上述實(shí)驗(yàn)中的 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液于100ml的容量瓶中、定容、待用。

⑴用甲醛法測(cè)定

另取20ml的待測(cè)溶液，加入2滴酚酞指示劑，用 NaOH滴加到 剛好顏色變成粉紅色30秒內(nèi)顏色不變化，加入甲醛溶液10mL，再加入百里酚藍(lán)指示劑10滴，用0.001mol/L的 NaOH滴定至藍(lán)紫色，30s內(nèi)不褪色為終點(diǎn)，記錄加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)。

⑵用吸光度法測(cè)定

①吸收曲線(xiàn)的制作和測(cè)量波長(zhǎng)的選擇

用吸量管吸取0.0mL和1.0mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入兩個(gè)50mL容量瓶中，各加入20.0mL緩沖溶液，20.0mL顯色劑，水稀釋到刻度，混勻。于100℃水浴中加熱15min，取出用冷水冷卻到室溫，移入1cm比色皿，以試劑空白為參比，在360—460nm之間，每隔5nm測(cè)一次吸光度，在坐標(biāo)紙上，以波長(zhǎng)λ為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制A與λ關(guān)系的吸收曲線(xiàn)，從吸收曲線(xiàn)上選擇測(cè)定N的適宜波長(zhǎng)，一般選用zui大吸收波長(zhǎng)。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

在7個(gè)50mL的容量瓶中，用移液管分別加入0mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL1mg/L氨氮溶液，均加入20mL緩沖溶液，20mL顯色劑，搖勻，再用水稀釋到刻度，搖勻。于100℃水浴中加熱15min,取出用冷水冷卻到室溫。用1cm比色皿，以試劑為參比溶液，在所選擇的波長(zhǎng)下，測(cè)量各溶液的吸光度。以含N量為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

③食用米醋中氨基酸含氮量測(cè)定

用移液管準(zhǔn)確吸取適量待測(cè)液10mL于50mL容量瓶（或比色皿）中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作步驟，加入各種試劑，測(cè)量吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出和計(jì)算試液中鐵的含量（單位為μg/mL）

五、數(shù)據(jù)記錄和結(jié)果

1、鄰苯二甲酸氫鉀（KHP）的稱(chēng)重（每份約0.4～0.5g）

2、氫氧化鈉溶液濃度的標(biāo)定

計(jì)算公式：C_NaOH= m_KHP/M_KHP×V_NaOH×10^-3

3、食用米醋中總酸量的測(cè)定

4、食用米醋中氨基酸氮含量的測(cè)定

用甲醛法測(cè)定：

計(jì)算公式：米醋氮含量=1/10×V_NaOH×C_NaOH*M_N

用吸光度法測(cè)定：

1、吸收曲線(xiàn)的制作

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作及溶液含鐵量的測(cè)定

吸取待測(cè)液體積（mL）：  10.00mL        

定  容  體  積（mL）：  50mL

在曲線(xiàn)上查得米醋含量： 0.010 ug/mL     

計(jì)算原試液中氮的含量： 0.050 ug/mL

六、問(wèn)題與討論

1、為什么稱(chēng)取鄰苯二甲酸氫鉀基準(zhǔn)物要在0.4-0.6g范圍內(nèi)？能否少于0.4g或多于0.6g？為什么？

因?yàn)橐话惴治鎏炱降恼`差為±0.0002g，為了使測(cè)量的相對(duì)誤差在0.1%以下，式樣的質(zhì)量就不可以太小，從相對(duì)誤差的計(jì)算中就可以得到試樣的質(zhì)量必須在0.2g以上，所以稱(chēng)取得質(zhì)量在0.4g以上可以保證用分析天平的誤差在允許的范圍之內(nèi)，又因?yàn)樵诘味ǚ治鲋?，滴定管讀書(shū)常有±0.01的誤差，在一次滴定中，需要讀數(shù)兩次，因此，可能造成±0.02的誤差，所以，為了使測(cè)量時(shí)的相對(duì)誤差小于0.1%，消耗滴定劑的用量必須在20.00ml以上，以減小相對(duì)誤差，所以稱(chēng)取鄰苯二甲酸氫鉀基準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量在0.4—0.6g以?xún)?nèi)，可以保證本次實(shí)驗(yàn)中滴定鄰苯二甲酸氫鉀所用的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積即在20.00以上，又不至于太多，方便操作。

2、加入百里酚藍(lán)指示劑的量可以隨意定嗎？如果不可以，多少才比較合適？

加入百里酚藍(lán)指示劑的量不同，對(duì)滴定終點(diǎn)的觀察是有影響的，在上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中當(dāng)?shù)稳氚倮锓铀{(lán)的量為2-3滴的時(shí)候，滴定終點(diǎn)的顏色是粉紅色的，而且不明顯，隨著滴數(shù)的增加，滴定終點(diǎn)的顏色逐漸明顯，當(dāng)加了12滴左右的時(shí)候，滴定終點(diǎn)變成藍(lán)紫色，比較容易觀察。

3、實(shí)驗(yàn)中測(cè)量出來(lái)的酸的量可否用ρ_Hac（g.L^-1）表示？

不可以，因?yàn)槊状字胁粌H含有醋酸，還存在其他的酸，因此測(cè)出來(lái)的酸包含有其他各種形式的酸，所以要用每升溶液中含有氫離子的量來(lái)表示。

4、酚酞指示劑由物色變成微紅色時(shí)，溶液的pH為多少？變紅的溶液在空氣中放置會(huì)變成無(wú)色的原因是什么？

酚酞指示劑由物色變成微紅色時(shí)，溶液的pH為8左右。變紅的溶液在空氣中放置會(huì)變成無(wú)色的原因是溶液也會(huì)吸收空氣中的的二氧化碳等酸性氣體，使溶液的PH下降到8以下，所以溶液又會(huì)變成無(wú)色。

5、 實(shí)驗(yàn)中的甲醛的用量是否可以隨意加入？是否越多越好？

不是的，當(dāng)加入的量太少時(shí)，-NH2無(wú)法充分反應(yīng)，這時(shí)候測(cè)出來(lái)的值會(huì)偏小。而甲醛是致癌物質(zhì)，無(wú)論是吸入蒸汽還是攝入液體都會(huì)引起中毒，對(duì)眼、皮膚和呼吸器官有強(qiáng)烈的刺激，所以不能用過(guò)多的甲醛。

6、參比溶液有什么作用？本實(shí)驗(yàn)中的用什么做參比？

用參比溶液來(lái)調(diào)節(jié)儀器的零點(diǎn)，可消除由于吸收池壁及溶劑對(duì)入射光的反射和吸收帶來(lái)的誤差，并消除干擾的影響，本實(shí)驗(yàn)用空白試劑，即0.0ml的氨氮溶液作為參比溶液。

7、 用吸光光度法測(cè)定的時(shí)候，溫度是否對(duì)反應(yīng)速度有影響？

有影響，本反應(yīng)隨著溫度的升高，反應(yīng)速度加快，當(dāng)把溶液放在100℃的水浴中加熱15min，即顯色*，吸光度達(dá)到zui高恒定值，當(dāng)我們把溶液放在室溫下，要等一天才能顯色*，可見(jiàn)溫度對(duì)顯色是有影響的。

8、顯色劑的量是否可以任意加入？

不是的，本實(shí)驗(yàn)顯色劑加入過(guò)少，則顯色不明顯，但如果顯色劑的量過(guò)多，又會(huì)使顯色過(guò)深，試劑難以分辨。而且在本實(shí)驗(yàn)中，如果加入過(guò)多顯色劑，待測(cè)液的顏色會(huì)比任何一瓶標(biāo)準(zhǔn)試劑都深。

9、用吸光光度法和甲醛法測(cè)出來(lái)的值為什么會(huì)有那么大差別？用吸光光度法有什么好處？

因?yàn)槊状字械渴稚?，用甲醛法測(cè)定的時(shí)候由于用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定鄰苯二甲酸氫鉀基準(zhǔn)物質(zhì)的時(shí)候有誤差，而且滴定含氮量用的氫氧化鈉濃度很低，滴定的過(guò)程中可能會(huì)與空氣中的二氧化碳反應(yīng)，又增大了誤差，所以甲醛法的誤差比較大，測(cè)得的值不太準(zhǔn)確。相對(duì)來(lái)說(shuō)，吸光光度法就有較高的準(zhǔn)確度和精密度，而且本法的操作簡(jiǎn)便，快速，靈敏，選擇性好，更適用于米醋中氨基酸氮含量的測(cè)定。