當(dāng)?shù)孜锇l(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的能量以光的形式釋放出來的時候，我們稱這個過程為化學(xué)發(fā)光。魯米諾（luminol）是常用的化學(xué)發(fā)光試劑之一，被過氧化物氧化后它會產(chǎn)生一種激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物——aminophthalate。這種產(chǎn)物衰變至低能態(tài)的同時釋放出光子。添加物可以提高魯米諾反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度和持續(xù)時間以及靈敏度。
化學(xué)發(fā)光底物被廣泛使用是因為其具有其他檢測方法不具備的優(yōu)點，這些優(yōu)點使得化學(xué)發(fā)光成為大多數(shù)蛋白實驗室檢測方法。使用化學(xué)發(fā)光可以通過多次曝光獲得成像結(jié)果。還可以將檢測試劑*去除，再對其他目的蛋白進(jìn)行檢測并成像，或?qū)z測條件進(jìn)行優(yōu)化。具有很寬的線性響應(yīng)范圍，從而可以檢測并定量很寬濃度范圍的蛋白質(zhì)。最重要的是，化學(xué)發(fā)光在所有的檢測方法中具有最高的靈敏度。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體和G-Biosciences公司的femtoLUCENT™ PLUS (貨號 # 786-003)，可以檢測的下限為飛克級，而這得益于這種底物中的增強(qiáng)劑可以很大程度地增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度并提高靈敏度。
化學(xué)發(fā)光底物與其他底物不同之處在于只有在酶和底物發(fā)生反應(yīng)的時候才會產(chǎn)生瞬時的可被檢測的光。這與那些可產(chǎn)生穩(wěn)定有顏色產(chǎn)物的底物不同；些有顏色的沉淀在酶-底物反應(yīng)結(jié)束之后仍然存在于膜上。在化學(xué)發(fā)光免疫印跡中，底物是反應(yīng)限制試劑。一旦其耗盡，光就會逐漸變?nèi)醪⑾?。實驗中一定要使用適當(dāng)稀釋濃度的抗體，這樣才會在幾小時內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的光信號輸出，從而維持蛋白檢測的一致性和靈敏度。當(dāng)抗體沒被足夠稀釋時，永遠(yuǎn)不會獲得穩(wěn)定的光信號輸出。系統(tǒng)中太多的酶會快速氧化底物并終止信號。
化學(xué)發(fā)光，魯米諾在HRP和雙氧水存在的條件下會被氧化形成激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物（3-aminophthalate）。3-aminophthalate在衰變至基態(tài)的過程中會發(fā)出波長為425nm的光。
femtoLUCENT™ PLUS
化學(xué)發(fā)光的優(yōu)點
靈敏性 | •強(qiáng)信號，低背景 •只需很少的抗原和抗體 |
快速 | •印跡上快速的底物處理 •信號在幾秒鐘之內(nèi)產(chǎn)生 |
穩(wěn)定 | •與放射性同位素不同，存放期很長 •4℃儲存 |
硬拷貝結(jié)果 | •用X光膠片捕獲結(jié)果 •結(jié)果不會隨時間而褪色，不用擔(dān)心膜的破裂 •長期保存 |
膠片結(jié)果 | •信號隨曝光時間增強(qiáng)而增強(qiáng) •可選擇在不同時間曝光 •可優(yōu)化顯色的方法 |
印跡可重新檢測 | •非同位素標(biāo)記的探針可從膜上洗掉 •可重復(fù)進(jìn)行免疫檢測 |
寬線性范圍 | •可檢測很寬范圍的蛋白濃度 |
可定量 | •可用反射型顯象密度計或成像設(shè)備 （例如CCD相機(jī)）掃描X光膠片 |
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