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胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
主要用途
胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)線粒體鈣離子特異性熒光探針Fura-2-AM，與鈣離子結(jié)合
后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光分光光度儀下測(cè)量不同激發(fā)波長(zhǎng)下相對(duì)熒光峰值的比值，來(lái)測(cè)定細(xì)胞漿
總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞
（動(dòng)物、人體等）或冰凍切片組織細(xì)胞漿鈣離子的濃度檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能
穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。
技術(shù)背景
鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate
apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散
型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活
性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular
excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。
在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中細(xì)胞漿鈣離子在調(diào)節(jié)鈣離子通道，維持細(xì)
胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。細(xì)胞漿鈣的檢測(cè)包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame
photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器
的特殊的要求，以及需要線粒體、細(xì)胞漿分離。Fura-2 AM（acetoxy-methyl ester），一種具有細(xì)胞膜通透性，
與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光的染料，通過(guò)其不同激發(fā)波長(zhǎng)340nm/380nm產(chǎn)生的熒光信號(hào)比（散發(fā)波長(zhǎng)510nm）來(lái)
測(cè)定細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子水平。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
介導(dǎo)液（Reagent C） 微升
飽和液（Reagent D） 毫升
陰性液（Reagent E） 毫升
裂解液（Reagent F） 微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)1 份
保存方式
保存染色液（Reagent B）和介導(dǎo)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，
有效保證6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于工作液配制的容器
細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育
96 孔培養(yǎng)板：用于樣品操作的容器
熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察
實(shí)驗(yàn)步驟
一、測(cè)定準(zhǔn)備
1． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀：激發(fā)波長(zhǎng)340nm 和380nm，散發(fā)波長(zhǎng)510nm
2． 測(cè)定開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出微升
介導(dǎo)液（Reagent C）和微升染色液（Reagent B）到新的1.5 毫升離心管，標(biāo)記為染色工作液，
并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。
二、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)
1． 準(zhǔn)備1 個(gè)96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，標(biāo)記為：細(xì)胞樣品孔、空白對(duì)照孔（不含細(xì)胞）、大對(duì)照孔（含細(xì)胞）
2． 小心抽去細(xì)胞樣品孔的培養(yǎng)液
3． 加入微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞樣品孔里
4． 加入微升飽和液（Reagent D）到大對(duì)照孔里
5． 加入微升陰性液（Reagent E）到空白對(duì)照孔里
6． 分別加入微升染色工作液到所有孔里
7． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻
8． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60 分鐘，避免光照
9． 小心抽去細(xì)胞樣品孔里的上清液
10．小心加入微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞樣品孔里
11．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟11 和12 一次
12．放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30 分鐘
13．加入微升裂解液（Reagent F）到大對(duì)照孔里
14．放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15 分鐘
15．即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀：獲得相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）包括樣品RFU340nm、
樣品RFU380nm、空白對(duì)照孔R(shí)FU340nm、空白對(duì)照孔R(shí)FU380nm、大對(duì)照孔R(shí)FU340nm、大對(duì)照孔
RFU380nm
16．計(jì)算樣品細(xì)胞漿鈣離子濃度
三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測(cè)
1． 準(zhǔn)備1 個(gè)待測(cè)的細(xì)胞爬片樣品
2． 小心加上微升清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
3． 小心移去樣品上的清理液（Reagent A）
4． 移取微升清理液（Reagent A）到新的1.5 毫升離心管
5． 加入微升染色工作液，混勻
6． 小心加上上述含有染色工作液的溶液到樣品上，覆蓋樣品表面
7． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60 分鐘，避免光照
8． 小心移去樣品上的染色工作液
9． 小心加上微升新鮮的清理液（Reagent A）
10．小心移去清理液（Reagent A）
11．小心加上微升新鮮的清理液（Reagent A）
12．放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30 分鐘
13．小心移去清理液（Reagent A）
14．蓋上蓋玻片
15．即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)340 至400nm，散發(fā)波長(zhǎng)510nm（細(xì)胞漿鈣離子
呈現(xiàn)藍(lán)色熒光）
四、冰凍切片檢測(cè)
1． 準(zhǔn)備1 個(gè)待測(cè)的冰凍切片
2． 小心加上微升清理液（Reagent A），覆蓋切片樣品表面
3． 小心移去樣品上的清理液（Reagent A）
4． 移取微升清理液（Reagent A）到新的1.5 毫升離心管
5． 加入微升染色工作液，混勻
6． 小心加上上述含有染色工作液的溶液到切片樣品上，覆蓋樣品表面
7． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60 分鐘，避免光照
8． 小心移去切片上的染色工作液
9． 小心加上微升新鮮的清理液（Reagent A）
10．小心移去清理液（Reagent A）
11．小心加上微升新鮮的清理液（Reagent A）
12．放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30 分鐘
13．小心移去清理液（Reagent A）
14．蓋上蓋玻片
15．即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)340 至400nm，散發(fā)波長(zhǎng)510nm（組織細(xì)胞漿鈣
離子呈現(xiàn)藍(lán)色熒光）
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20 次（顯微鏡）或60 次（酶標(biāo)板）操作
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 可以使用熒光分光光度儀檢測(cè)
4． 如果細(xì)胞內(nèi)酯酶缺失，則建議使用微注射（microinjection）技術(shù)
5． 避免使用EDTA 等處理樣品
6． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
7． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
8． 檢測(cè)敏感度可達(dá)納摩爾級(jí)鈣濃度范圍
9． 本公司提供系列鈣生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感