化工儀器網(wǎng)技術(shù)文章
組織長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶活性比色法定量檢測試劑盒說明書
閱讀：961 發(fā)布時(shí)間：2023-4-12主要用途
組織長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶（KETOACYL COA THIOLASE）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用酮脂酰輔酶A作為底物，在鎂離子和輔酶A的激活下，底物解離后峰值的降低，即采用比色法來測定組織裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體、昆蟲等）長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
脂肪酸β氧化過程（β-oxidation）在動(dòng)物組織的線粒體發(fā)生的脂肪酸代謝通路，可概括為活化、轉(zhuǎn)移、β-氧化及最后經(jīng)三羧酸循環(huán)被氧化生成CO2和H2O，并釋放能量等四個(gè)階段。硫解酶（Thiolase）存在于真核和原核生物的細(xì)胞里，分成兩種類型：一種為酮脂酰輔酶A硫解酶（3-ketoacyl-CoA thiolase；EC: 2.3.1.16），另一種為乙酰乙酰輔酶A硫解酶（acetoacetyl-CoA thiolase；EC: 2.3.1.9）。酮脂酰輔酶A硫解酶又稱為硫解酶I（thiolase I），以各種鏈長脂肪酸為底物，催化脂肪酸β-氧化的最終反應(yīng)，釋放乙酰輔酶A，同時(shí)產(chǎn)生短缺2個(gè)碳基的脂酰輔酶A。在真核生物中，酮脂酰輔酶A硫解酶又分為線粒體型和過氧化酶體型。長鏈酮脂酰輔酶A（例如酮十六脂酰輔酶A；3-ketohexadecanoyl-CoA）在長鏈硫解酶I的催化下，發(fā)生鎂-烯醇化物（Mg-enolate）的裂解，致長鏈酮脂酰輔酶A底物的減少，在分光光度儀（303nm）下，吸光值降低，來定量分析長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶的活性。長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶反應(yīng)系統(tǒng)為：
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣品準(zhǔn)備
1．手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重500毫克組織重量
2．（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3．（選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗
4．（選擇步驟）抽去清理液
5．移入到一個(gè)液氮凍存管
6．即刻放進(jìn)液氮罐過夜
7．次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
8．放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
9．加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B）
10．強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11．放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆茫?/span>
12．即刻放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
13．小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
14．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
15．放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、測定準(zhǔn)備
1．開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長303nm，間隔30秒，讀數(shù)5次（共3分鐘），并置零
2．從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化
3．緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、背景對照測定
1．移取800微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入50微升反應(yīng)液（Reagent D）
3．加入100微升底物液（Reagent E）
4．上下傾倒數(shù)次，混勻
5．在25℃溫度下孵育3分鐘
6．加入50微升陰性液（Reagent F）
7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數(shù)－3分鐘讀數(shù)）
四、樣品測定
1．移取800微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入50微升反應(yīng)液（Reagent D）
3．加入100微升底物液（Reagent E）
4．上下傾倒數(shù)次，混勻
5．在25℃溫度下孵育3分鐘
6．加入50微升待測樣品（10微克蛋白總量）（注意：樣品須清澈）
7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－3分鐘讀數(shù)）
五、計(jì)算樣品活性
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 13.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 3（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾酮脂酰輔酶A /分鐘
六、酶標(biāo)儀測定
1．在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
2．分別移取200微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3．分別加入12.5微升反應(yīng)液（Reagent D）
4．分別加入25微升底物液（Reagent E）
5．輕輕搖動(dòng)96孔板
6．在25℃溫度下孵育3分鐘
7．分別加入12.5微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（10微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
8．輕輕搖動(dòng)96孔板
9．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和3分鐘讀數(shù)
10．活性計(jì)算：
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.0125（樣品容量；毫升）X 13.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 3（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾酮脂酰輔酶A/分鐘