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組織NADPH細(xì)胞色素C還原酶活性 比色法定量檢測方法
閱讀：2759 發(fā)布時間：2019-11-150303.2 v.A
組織NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性
比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書
主要用途
組織NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過NADPH細(xì)胞色素C還原酶反應(yīng)系統(tǒng)中，細(xì)胞色素C還原后峰值的增高，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）或純化微粒體樣品NADPH細(xì)胞色素C還原酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase；EC1.6.2.4），又稱為NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NADPH-cytochrome P450 reductase；CPR），是一種微粒體（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）內(nèi)電子傳導(dǎo)鏈的黃素蛋白酶，參與藥物、脂肪酸、固醇類、外源性化學(xué)分子等羥基化代謝作用，啟動脂質(zhì)過氧化作用。通過傳遞來自NADPH的電子到細(xì)胞色素b5或細(xì)胞色素P450家系的酶，包括血紅素氧合酶等，然后鏈接到脂肪酸去飽和酶（desaturase）和延伸酶（elongase）通路上。NADPH細(xì)胞色素C還原酶存在于所有組織細(xì)胞，肝組織高度表達(dá)，受到垂體-甲狀腺軸調(diào)控。NADPH細(xì)胞色素C還原酶是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)記蛋白，飲食類脂質(zhì)和生態(tài)污染的生物學(xué)標(biāo)記。基于底物氧化型細(xì)胞色素C，在輔酶NADPH的存在下，由NADPH細(xì)胞色素C還原酶催化作用，產(chǎn)生還原型細(xì)胞色素C，由此出現(xiàn)吸光峰值的變化（550nm波長），來定量測定NADPH細(xì)胞色素C還原酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 毫升
底物液（Reagent E） 毫升
陰性液（Reagent F） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作
超速離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿或酶標(biāo)板：用于反應(yīng)和比色的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣品準(zhǔn)備
1.手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量（實(shí)驗(yàn)前使動物空腹12至24小時）
2.（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3.（選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4.移入一個液氮凍存管
5.即刻放進(jìn)液氮罐過夜
6.次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
7.放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
8.加入xx毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent B）
9.渦旋震蕩5秒，充分混勻
10.即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
11.在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約40下）
12.將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
13.放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心30分鐘，速度為9000g
14.移取上清液到2個新的1.5毫升離心管
15.放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60分鐘，速度為100000g
16.小心抽去上清液
17.分別加入xx微升裂解液（Reagent B）
18.合并到1個1.5毫升離心管
19.移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
20.即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測定準(zhǔn)備
1．準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
2．設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為550nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
三、背景對照測定
1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
3．加入xx微升底物液（Reagent E）
4．放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
5．加入xx微升陰性液（Reagent F）
6．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：550波長讀數(shù)5分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘
四、樣品活性測定
1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
3．加入xx微升底物液（Reagent E）
4．放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
5．加入50微升待測樣品（注意：100微克微粒體蛋白；樣品須溶解；參見注意事項(xiàng)10）
6．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數(shù)：550波長讀數(shù)5分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘
五、計算樣品活性
注意事項(xiàng)
1．本產(chǎn)品為20次（比色皿）操作，包括背景對照
2．操作時，須戴手套
3．系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4．樣品須澄清，至關(guān)重要
5．加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測定
6．分光光度計波長嚴(yán)格設(shè)置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號
7．測定值由低到高變化；測定可以持續(xù)5分鐘
8．測定值由低到高變化，即5分鐘測定讀數(shù)高于0分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
9．比色測定后，比色皿須清洗*
10．建議待測樣本為微粒體，其蛋白濃度為100微克/50微升；待測樣本為組織裂解懸液，其總蛋白濃度為250至500微克/50微升（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
12．通常每毫克肝組織蛋白含有1至5毫單位NADPH細(xì)胞色素C還原酶
13．NADPH細(xì)胞色素C還原酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾細(xì)胞色素C所需的酶量作為一個活性單位
14．本公司提供系列NADPH細(xì)胞色素C還原酶檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感