一．“豬血小板活化因子(PAF)ELISA試劑盒”實驗原理：

    ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。

二、樣品收集、處理及保存方法：

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量shengli鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品：

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

三、“豬血小板活化因子(PAF)ELISA試劑盒”操作注意事項：

1.試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。

2.實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.標準品稀釋液即可視為陰性對照或者空白；預(yù)處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。

  4.嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

  5.所有液體組分使用前充分搖勻。

四、試劑盒組成：

注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：120、60、30、15、7.5、3.75pg/mL

試劑的準備

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

五、洗板方法：

1.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

六、操作步驟：

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

4.隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

七、結(jié)果判斷：

 繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣

八、“豬血小板活化因子(PAF)ELISA試劑盒”試劑盒性能：

1.  準確性：標準品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0pg/mL。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.  重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個月

免責聲明：

1.試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。

2.嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。