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            上海北諾生物科技有限公司
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            地址：
            
                              
            上海市徐匯區(qū)宜山路520號中華門大廈18樓D座
            
                            
            
                                                     
            
              
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            網(wǎng)址：
            
          
            www.bnbiotech.com
            
        
            
            
        
            
            
            
            
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            十招搞定免疫熒光
            2015-1-22　　閱讀(1396)
            

            
							
				
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            免疫熒光是標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展zui早的一種，它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)，通過將抗體與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光步驟包括，細(xì)胞固定和通透，封閉，孵育一抗，二抗等。除了這些基本步驟，以下建議可以幫助您獲得更好的實驗結(jié)果。
            細(xì)胞固定和通透

            為達(dá)到*的檢測效果，細(xì)胞需要經(jīng)過固定和通透。這些步驟非常關(guān)鍵，細(xì)胞和抗原需要保證*的結(jié)構(gòu)，并利于抗體與抗原結(jié)合。通常情況下，需要通過以下步驟得以實現(xiàn)：細(xì)胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進(jìn)行通透。前者是比較溫柔的處理，但是對于核內(nèi)抗原可能無效，需要用到Triton。使用皂角苷進(jìn)行通透時，要注意它會引起細(xì)胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個抗體孵育環(huán)節(jié)都需要進(jìn)行通透。另外，細(xì)胞可以用冰甲醇進(jìn)行同時固定和通透，可以避免去垢劑的使用。
            抗體特異性

            免疫熒光需要用到特異性非常強(qiáng)的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果。在大多數(shù)情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照，有利于減少降低背景干擾。
            合適的抗體稀釋比例

            通過優(yōu)化抗體稀釋比例來優(yōu)化染色，通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強(qiáng)度。如果是*次使用該抗體或測定某抗原，強(qiáng)烈建議濃度梯度實驗。
            優(yōu)化緩沖液和封閉劑

            盡管很多抗原在常見的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是對于某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來很大程度上的改善。Rockland可提供優(yōu)化過的IHC用封閉緩沖液，同樣適用于熒光染色實驗。
            選擇正確的二抗

            如果您需要做免疫實驗，我們強(qiáng)烈建議您選擇進(jìn)行過預(yù)吸附的二抗進(jìn)行單染實驗；如果是雙重甚至是多重染色，那么必須使用預(yù)吸附的二抗。同時，請優(yōu)先選擇來自同一物種的二抗。
            使用合適的細(xì)胞密度

            選擇合適的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行染色，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量過多時，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不好，導(dǎo)致染色背景深，低細(xì)胞密度，會使細(xì)胞貼壁不佳，狀態(tài)不好。
            多重染色

            對同一樣本進(jìn)行兩個不同抗原的檢測時，可以用各自的抗體進(jìn)行同時染色，但要求兩個一抗的種屬來源不同，標(biāo)記物不同，而二抗的種屬來源需保持一致。
            降低背景

            高背景是免疫熒光常見的問題，解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替BSA做封閉液，降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)，洗滌至少三次，每次五分鐘，推薦洗滌液為PBS+0.05%Tween。
            封片

            作為免疫熒光的zui后一步，可以提高折射率，保護(hù)樣品。
            數(shù)據(jù)分析

            觀察整體樣片時，選擇具有代表性的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析。
            詳情見：http://www.rockland-inc。。ｃｏｍ/IF-Microscopy-Tips.aspx?utm_source=tips&utm_medium=&utm_campaign=marker 
            
      
            
      
      
            
    
            
    
            
  
            

            
		 







  
    
    				
			

		
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

    

     
     
     
	 



	
	
	


            
	
            
		
            
			
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