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雙抗夾心ELISA法重點(diǎn)分析
閱讀：148 發(fā)布時間：2024-4-16酶聯(lián)免疫吸附分析Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA是以體外抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原抗體特異性反應(yīng)與酶的高效催化作用相結(jié)合的一種檢測方法，靈敏度可達(dá)皮克(pg/mL)水平。
常見的ELISA類型雙抗體夾心法，其基本原理是將定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待檢標(biāo)本，通過加入檢測抗體，酶標(biāo)記第二抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈正相關(guān)。
1、包被抗體
許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚丙酰胺和纖維素等，在進(jìn)行抗體固定化之前，需要對酶標(biāo)板材進(jìn)行篩選。酶標(biāo)板由親水到疏水，對蛋白的結(jié)合會由強(qiáng)變?nèi)?，造成吸附能力的差異。將抗體吸附在固相載體表面時，要求純度要好，吸附時一般要求pH在9.0～9.6之間。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：用不同的蛋白質(zhì)濃度包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本OD值，選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。
2、標(biāo)準(zhǔn)品及樣本
標(biāo)準(zhǔn)品即為目標(biāo)物（樣本中待檢測因子）的純蛋白，從母液稀釋到級聯(lián)稀釋都需要特別留意，標(biāo)曲的制作是ELISA實驗成功的關(guān)鍵。待檢目標(biāo)物需具備多個抗原表位，即二價或二價以上的大分子抗原，因為這種檢測方法需要兩種抗體。另外，需要注意的是血清樣本中的類風(fēng)濕因子（RF）干擾——RF能與多種動物的變性IgG的Fc部分結(jié)合而產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。
3、洗滌液
ELISA操作中會涉及到多次洗板。長時間的孵育后，會出現(xiàn)非特異性結(jié)合，這時就需要洗滌液來洗去非特異性結(jié)合的蛋白或抗體，通常為PBS，洗4-6次，每次30s左右。多次短時間洗板比少次長時間洗板更有效，在最后一次洗板時，盡量拍凈液體，同時注意讓板子保持濕潤。
4、檢測抗體
雙抗體夾心法中的檢測抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合位點(diǎn)需要有別于目標(biāo)物與包被抗體結(jié)合的位點(diǎn)，即會涉及抗體配對的問題。常用的抗體配對方法有下幾種：
1）、 包被抗體為單抗，檢測抗體為多抗；
2）、包被抗體為單抗，檢測抗體為單抗，但這兩種單抗針對的抗原表位不同；
3）、包被抗體為多抗，檢測抗體為多抗，這兩種多抗一般來源于不同的宿主。
5、生物素標(biāo)記的二抗
鑒于酶標(biāo)二抗的局限性，現(xiàn)在廠家一般引入生物素親和素系統(tǒng)(biotin avidin system, BAS)，這種系統(tǒng)在提高反應(yīng)靈敏度的同時，應(yīng)用起來也更加方便。進(jìn)行生物素標(biāo)記時，可依據(jù)抗體所帶可標(biāo)記基團(tuán)種類（氨基、醛基、巰基等）以及分子酸堿性選擇相應(yīng)的活化生物素和反應(yīng)條件。生物素標(biāo)記后，不影響被標(biāo)記物的生物活性。
6、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素
每個親和素分子可與4個生物素分子結(jié)合，所以可以偶合更多連接生物素的酶分子，從而大大提高了ELISA實驗的靈敏度。生物素和親和素間的親和力強(qiáng)，二者一旦結(jié)合，就極為穩(wěn)定，而且這種結(jié)合反應(yīng)時間比抗原抗體反應(yīng)所需時間短。在BAS檢測中多用鏈霉親和素“streptavidin, SA"，它是鏈霉菌培養(yǎng)過程中的分泌物，由4條相同的肽鏈組成。HRP靈敏，穩(wěn)定，比活性高，分子量小，純酶容易制備。其有4對半胱氨酸形成的二硫鍵，99位Asp和123位Arg形成的鹽橋，9個潛在的糖基化位點(diǎn)，有兩個金屬中心，可催化顯色底物TMB產(chǎn)生藍(lán)色一價物。
7、顯色底物
由于 TMB比其他顯色底物具有更高的靈敏度且無致癌性、故而被廣泛使用。HRP 或其他適當(dāng)過氧化物酶能在過氧化氫存在下催化TMB生成可溶的藍(lán)色物，此時通?？稍?nbsp;370nm 測定吸光度。當(dāng)顯色反應(yīng)被酸性溶液終止后，產(chǎn)物由藍(lán)色一價物轉(zhuǎn)為黃色二價物，此時可在 450nm 測定吸光度。