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所有的固定方案必須做到：①防止抗原丟失；②透化細(xì)胞以便使抗體進(jìn)入；③盡量使抗原保持能與抗體結(jié)合的狀態(tài)；④維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)。
常用的固定劑種類很多，固定劑的正確選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性。固定劑可分為兩大類：有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑。有機(jī)溶劑如乙醇和丙酮能夠去除脂類物質(zhì)使細(xì)胞脫水，把蛋白質(zhì)沉淀在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上。交聯(lián)劑一般通過自由氨基基團(tuán)把生物分子橋連起來，形成一個(gè)相互連接的抗原網(wǎng)。兩種方法均使蛋白質(zhì)抗原部分變性。因此，在細(xì)胞染色中，能夠識別變性蛋白的抗體更加有用。在某些情況下，只有用此類抗體才能得到滿意的結(jié)果。
往往憑經(jīng)驗(yàn)選擇固定劑。雖然許多人發(fā)現(xiàn)用交聯(lián)劑固定細(xì)胞可以獲得較好的結(jié)果，但沒有通用規(guī)則可以參考?？梢栽囉脙煞N方法，然后選擇較好的一種。
懸浮細(xì)胞染色通常用于檢測細(xì)胞表面抗原。因?yàn)榧?xì)胞呈懸浮狀態(tài)，洗滌過程復(fù)雜，因此，應(yīng)注意離心時(shí)間不要過長或轉(zhuǎn)速太高。
1．所需溶液
4％多聚甲醛(臨用前配制)、PBS。
2．操作步驟
(1)PBS配制4％多聚甲醛；
(2)用PBS洗滌細(xì)胞2次，用200g離心5min；重懸細(xì)胞。
(3)小心用4％多聚甲醛溶液懸浮細(xì)胞，細(xì)胞濃度約為1X106／m1 15min，間或搖動；
(4)200g離心5rain，用PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次；室溫下靜置
(5)用含0．2％TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化細(xì)胞2min(室溫)，有的抗原需15min，具體時(shí)間視抗原而定；
(6)200g離心5rain，用PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。
此時(shí)的細(xì)胞標(biāo)本可用于后續(xù)的抗體檢測。
