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細胞凋亡檢測試劑盒的原理、使用方法及注意事項
細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡是為維持環(huán)境穩(wěn)定，為更好的適應(yīng)勝春環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等作用，是一種字體損傷的現(xiàn)象。zui常用的目前就是細胞凋亡檢測試劑盒。
細胞凋亡檢測試劑盒原理
細胞凋亡是細胞的基本特征之一，在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一種分子量為35.8 KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）高親和力特異結(jié)合。FITC-Annexin V結(jié)合到凋亡細胞后，在藍色光的激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，區(qū)分出凋亡細胞與正常細胞。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種核酸染料，它不能穿透完整細胞膜，但對凋亡晚期細胞和死細胞的破損細胞膜能夠穿透，并使細胞核紅染。將FITC-Annexin V與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞區(qū)分開來。
細胞凋亡檢測試劑盒使用步驟
1. 調(diào)整待測細胞的濃度為5×105-1×106個/ml。 2. 取1ml細胞，1000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清。 3. 加入1ml預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清（對于貼壁細胞，先用胰酶消化，再用PBS洗滌）。 4. 重復(fù)步驟3兩次。 5. 將細胞重懸于200μl Binding Buffer。 6. 加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘 或4℃反應(yīng)30 分鐘。 7. 加入300μl Binding Buffer，在1小時內(nèi)用流式細胞儀檢測。 8. 若用熒光顯微鏡檢測，將細胞混合液離心，取細胞沉淀涂片，再進行觀察。
使用細胞凋亡檢測試劑盒的注意事項
為保證得到理想的實驗結(jié)果在使用此試劑盒之前請認(rèn)真閱讀該注意事項。
1.旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
2.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物質(zhì)，在保存與操作時請注意避光。
3.Propidium iodide（PI）能通過皮膚吸收，對眼睛有刺激作用。
4.在細胞洗滌的zui后一步，請盡量將上清棄凈，以免PBS殘留影響實驗結(jié)果。
5.PI染色時間過長有可能造成檢測的凋亡率偏高，建議首先進行Annexin V-FITC染色，上機前5分鐘再加入PI染色。
6.整個操作過程動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞，盡量在4℃下操作。
7.反應(yīng)完畢后請盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態(tài)的過程，反應(yīng)1小時后熒光強度就開始衰變。
8.成功的檢測凋亡受以下幾種因素的影響，如細胞類型、細胞膜上PS的密度、發(fā)生凋亡時PS翻轉(zhuǎn)的比例、誘導(dǎo)細胞凋亡的方法、所用試劑、誘導(dǎo)凋亡的時間等，把這些影響因素進行優(yōu)化對實驗成功是非常必要的。
