可樂(lè)定檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

【原理】

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物可樂(lè)定與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗磺胺的抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含可樂(lè)定的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出殘留物可樂(lè)定的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度：0.2ppb

檢測(cè)時(shí)間： 45min

樣本檢測(cè)下限：

尿     樣  …………………………………   0.2ppb

組    織   …………………………………  0.4ppb

飼    料  …… ……………………………   8ppb

交叉反應(yīng)率：

可樂(lè)定…………………   100%

樣本回收率：

尿     樣   ……………………… 95%±10%

組     織   ……………………… 85%±15%

飼     料   ……………………… 85%±15%

【試劑盒組成】

2、 微量測(cè)試孔：1×96孔板（12條×8孔）

3、 （標(biāo)準(zhǔn)溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb

4、 可樂(lè)定高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（1ml/瓶）100 ppb

5、 酶標(biāo)記物 7ml…………………………紅色帽

6、 抗體工作液  7ml……………………… 綠色帽

7、 底物A液     7ml  ……………………棕色帽

8、 底物B液     7ml  ……………………黑色帽

9、 終  止  液     7ml  ……………………黃色帽

10、 2X濃縮復(fù)溶液50 ml  ………………藍(lán)色帽

11、 2X濃縮洗滌液40 ml  ………………白色帽

【 所用儀器、試劑】

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、氮?dú)獯蹈裳b置、打印機(jī)、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機(jī)、恒溫箱、天平（感量0.01g）、刻度移液管

微量移液器：?jiǎn)蔚?/span>20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl

試            劑： 濃HCl、甲醇、

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

配液3、 0.1M HCl 溶液

取0.86ml濃HCl加水定溶至100ml。

配液4、樣品提取液溶液

               取1ml  0.1M鹽酸加到99ml甲醇中。

【樣本前處理步驟】

樣本處理前須知

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（c）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（a）尿樣本的處理方法（樣本稀釋倍數(shù)：1）

取50µl清亮尿樣直接測(cè)定（如果尿樣渾濁一定要過(guò)濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

由于尿液陰性樣本可能會(huì)產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3即0.3ppb作為尿液陽(yáng)性結(jié)果的CUT OFF判斷值。

（b）組織樣本的處理方法（樣本稀釋倍數(shù)：2）

1． 稱取2 ±0.05g的組織，加入4ml樣品提取液，振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min。

2． 取上清2ml，于50℃氮?dú)饣蚩諝?/span>吹干。

3． 加1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。

4． 取50µl進(jìn)行分析。

（C）飼料樣品的處理方法（樣本稀釋倍數(shù)：40）

1. 稱1.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入4ml樣品提取液，放振蕩器上振蕩2min；室溫 4000r/min以上離心10min；

2. 取出上清液50ul與450ul稀釋好的復(fù)溶液混合30s。

取50ul上清進(jìn)行分析。

【酶標(biāo)免疫分析程序】   

操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

5、 取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）

6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

7、 測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】   

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與可樂(lè)定的含量成負(fù)相關(guān)。

1、 粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng /ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.221，樣本2的吸光度值為0.795，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.81；0.2ppb為1.50；0.6ppb為1.114；1.8ppb為0.660； 5.4ppb為0.318；16.2ppb為0.145。則樣本1的濃度范圍是5.4ppb-16.2ppb；樣本2的濃度范圍是0.6ppb-1.8ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中可樂(lè)定實(shí)際含量。

2、 定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以可樂(lè)定濃度（ng /ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中可樂(lè)定實(shí)際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來(lái)電索取）

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

         0.2                0.6                1.8                   5.4               16.2

 (ppb) [µg/kg]

圖1：可樂(lè)定檢測(cè)試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV 

      0      0.2            0.6             1.8          5.4         16.2

(ppb) [µg/kg]

圖2：可樂(lè)定檢測(cè)試劑盒的精密度

由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出可樂(lè)定檢測(cè)試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)可樂(lè)定濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】   

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲(chǔ)存】

原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號(hào)見(jiàn)外包裝。

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