rokazyme生產(chǎn)和銷售用于研究，診斷和工業(yè)測試目的的新型酶。該公司成立于2006年，是冰島生物技術(shù)公司Prokaria的副產(chǎn)品，該公司后來合并為非營利性國有企業(yè)Matis。Prokazyme基于二十年的地?zé)嵘锟碧?，微生物基因組學(xué)和酶發(fā)現(xiàn)。Prokazyme（作為中小企業(yè)）與馬蒂斯組成了一個研究聯(lián)盟，并共同參與了由歐盟資助的一些研究項(xiàng)目。持續(xù)的研發(fā)和與Matis的戰(zhàn)略聯(lián)盟使Prokazyme有機(jī)會開發(fā)大量不斷增長的嗜熱細(xì)菌和病毒基因數(shù)據(jù)庫，并繼續(xù)開發(fā)新的*酶產(chǎn)品。

ThermoPhage™ Polynucleotide Kinase – Bacteriophage RM378

ThermoPhage™多核苷酸激酶 - 噬菌體RM378

ThermoPhage™多核苷酸激酶是一種新型的熱活性激酶，在高溫下催化DNA的5'磷酸化，是僅有可用的熱穩(wěn)定酶。 

ThermoPhage™多核苷酸激酶是一種新型的熱活性激酶，在高溫下催化DNA的5'磷酸化，是僅有可用的熱穩(wěn)定酶。該酶具有非常低的3'磷酸酶活性。Thermophage™多核苷酸激酶非常適合各種應(yīng)用，包括核酸的放射性標(biāo)記（Blondal等2005，J Biol Chem 280：5188-94）

提供500個單位和1000個單位（上面選擇的產(chǎn)品）以及10x反應(yīng)緩沖液。 

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產(chǎn)品：Pnk162S | 多核苷酸激酶500單位 | 價(jià)格：220.00 EUR

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產(chǎn)品：Pnk162L | 多核苷酸激酶1000單位 | 價(jià)格：320.00 EUR

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有關(guān)詳細(xì)信息，請參閱下文或下載產(chǎn)品說明書

介紹：

ThermoPhageTM多核苷酸激酶（PNK）催化磷酸（Pi）從ATP的γ-位置轉(zhuǎn)移到羥基化核酸（RNA或DNA，單鏈或雙鏈）的5'末端或?qū)i交換為單體。 - 磷酸化核酸（1）。ThermoPhageTM PNK來源于感染Rhodothermus marinus的噬菌體RM378（2）。從大腸桿菌中表達(dá)并純化重組PNK蛋白。ThermoPhageTM PNK的適溫度為60-70°C。對于短的孵育時(shí)間（1小時(shí)或更短），酶的適溫度約為70°C，但對于更長的孵育方案，我們建議60-65°C。ThermoPhage PNK具有Mn2 +依賴性3'磷酸水解酶活性，不會干擾其5'激酶活性。

應(yīng)用：

• 使用32P-γ-ATP標(biāo)記核酸用于探針和DNA測序。

• 核酸的磷酸化用于隨后的克隆連接。

• 用于連接酶反應(yīng)的寡核苷酸的磷酸化，如連接酶鏈反應(yīng)和類似程序（3-4）。

• 用修飾的磷酸（即硫醇 - 磷酸）對核酸進(jìn)行磷酸化，用于隨后的修飾和/或標(biāo)記。

注意：   ThermoPhage PNK受高濃度（> 50 mM）鹽濃度（KCl和NaCl）的抑制，并受到磷酸根離子和銨離子的強(qiáng)烈抑制。標(biāo)記5'磷酸化核酸（交換反應(yīng)）將在與正向反應(yīng)相同的緩沖液中起作用，但需要更多的時(shí)間和酶。如果使用包括RNA和RNA酶抑制劑在內(nèi)的方案，請確保它們在高溫下有活性，例如SUPERase InTM（Ambion）或RNAse-Free核糖核酸酶抑制劑（CHIMERx）。

儲存：
儲存和稀釋緩沖液：10mM Tris（pH 8），50mM KCl，0.1mM EDTA，0.1μMATP，1mM DTT和50％甘油。ThermoPhageTM PNK在-25至-15°C下儲存可穩(wěn)定一年。

單位定義的反應(yīng)條件：
1x反應(yīng)緩沖液（50mM MOPS（pH 8.5），1mM DTT，10mM MgCl 2,10mM KCl），2nmol ATP，25μg/ ml BSA，5％PEG6000,1nmol ssDNA寡核苷酸和ThermoPhageTM PNK酶在20μl體積中于70℃溫育15分鐘。

濃度和單位定義：
濃度25U /μl 
一個單位的ThermoPhageTM多核苷酸激酶催化在70℃下在30分鐘內(nèi)將1nmol的γ-磷酸從ATP轉(zhuǎn)移到寡核苷酸的5'羥基化末端（5）。

應(yīng)用協(xié)議：

反應(yīng)方案：
對于優(yōu)化的磷酸化反應(yīng)方案，在25-50μl反應(yīng)體積中使用10-20單位的酶與1x反應(yīng)緩沖液，5％PEG6000,25μg/ ml BSA，10-100μMATP和底物。在60-70°C孵育1-2小時(shí)。
對于使用32P的標(biāo)記反應(yīng)，33P-γ標(biāo)記的ATP使用10pmol標(biāo)記的ATP，至少10pmol底物和10單位PNK，如上所述在其標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。在60-70°C孵育1-2小時(shí)。
如果進(jìn)行交換5'激酶反應(yīng)，則增加孵育時(shí)間和/或使用的酶量。

活性測定：
1x ThermoPhageTM PNK緩沖液，25μg/ ml BSA，2nmol ATP（ATP和32P-γ-ATP的混合物）和1nmol ssDNA 5'羥基化寡核苷酸寡聚物底物和20μl反應(yīng)體積中的0.1-0.5單位PNK。在70℃溫育15分鐘后，通過在95℃加熱5分鐘終止反應(yīng)，并將樣品在DE81濾器上捕獲并在250mM磷酸鹽緩沖液中洗滌兩次。然后將過濾器干燥并在液體閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)放射性并測定磷酸鹽的摻入。

特征：

溫度穩(wěn)定性：
ThermoPhageTM多核苷酸激酶在60°C時(shí)穩(wěn)定，但在65-70°C的延長時(shí)間內(nèi)開始失活。標(biāo)準(zhǔn)測定在50,60,65和70℃下進(jìn)行，并且在0,30,60和120分鐘時(shí)取樣（圖1）。

圖1：在50-70℃下隨時(shí)間的熱穩(wěn)定性。該酶在50-60℃下穩(wěn)定，但在65-70℃的延長時(shí)間內(nèi)開始松散活性。

溫度宜：
ThermoPhage™多核苷酸激酶的適溫度在60°C至70°C之間。我們建議70°C的孵育時(shí)間短（1小時(shí)）。如果孵育時(shí)間較長，我們建議在60°C溫育。然而，如圖2所示，對于更短的孵育時(shí)間，酶在高達(dá)90°C時(shí)顯示出相對較高的活性。

圖2：在標(biāo)準(zhǔn)測定條件下在給定溫度下孵育1小時(shí)的ThermoPhageTM多核苷酸激酶的活性。

5'激酶活性：
在標(biāo)準(zhǔn)條件下用10μMATP（32P-γ-和未標(biāo)記的ATP的混合物）和20μMdA20或rA20寡聚體和5％PEG6000測定ThermoPhage多核苷酸激酶。反應(yīng)時(shí)間在70℃下在10μl反應(yīng)體積中30分鐘。加入終止溶液（95％甲酰胺20mM EDTA，0.05％溴酚藍(lán)和0.05％二甲苯Cyanol FF）終止反應(yīng)。樣品在20％UREA-PAGE凝膠上電泳，干燥并放射自顯影。

圖3：標(biāo)準(zhǔn)條件下ssDNA（dA20）和RNA（rA20）的磷酸化。PAGE凝膠顯示使用5單位ThermoPhage PNK酶在標(biāo)記反應(yīng)中*耗盡ATP。

3'磷酸水解酶活性：
ThermoPhageTM PNK在pH5-7時(shí)具有宜的3'磷酸水解酶活性，主要存在于Mn2 +中，如圖4所示。主要底物是2'-3'cAMP，如圖5所示。水解酶活性不應(yīng)干擾ThermoPhageTM PNK的5'激酶反應(yīng)。

圖4： 2'-3'cAMP上ThermoPhageTM PNK 3'磷酸水解酶活性的pH曲線。

圖5： ThermoPhage PNK和T4 PNK在100μM2'-3'cAMP，3'TMP和dA15-PO4-底物上的3'磷酸水解酶活性的比較。

質(zhì)量控制：
如下所述測定每批ThermoPhageTM多核苷酸激酶的活性和污染活性。

缺乏DNA核酸內(nèi)切酶：

• 將0.25μg超螺旋pBR322 DNA與增加量的ThermoPhageTM PNK在25μl反應(yīng)中于37℃和64℃溫育4小時(shí)。100U的ThermoPhageTM PNK顯示pBR322 DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)沒有松弛。

• 將0.25μgλ-DNA Eco RI / HindIII片段與ThermoPhageTM PNK在25μl反應(yīng)中于37℃和64℃溫育4小時(shí)。100U的ThermoPhageTM PNK顯示沒有改變條帶圖案。

不含核酸外切酶：將
增加量的ThermoPhageTM PNK在含有[3H] - 標(biāo)記的DNA的50μl測試緩沖液中于37℃和64℃溫育4小時(shí)。顯示無外切核酸酶活性的酶量至少為200單位。

缺乏Rnases：
來自Ambion的RNaseAlertTM實(shí)驗(yàn)室測試試劑盒（目錄號1964）用于根據(jù)制造商的方案檢測RNase活性。在100單位ThermoPhageTM PNK孵育1小時(shí)后未檢測到RNase活性。

參考文獻(xiàn)：

• Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，EF和T.，M。（1989）Molecular cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY。

• Hjörleifsdottir，S。等。（2002）嗜熱宿主生物的噬菌體RM 378 - 美國專li號6,492,161
•  

Blondal等人。（2005）來自噬菌體RM378的5'-多核苷酸激酶/ 3'-磷酸酶的表征-J Biol Chem 280：5188-94。

• Wu，DY＆Wallace，RB（1989）Genomics 4,560-569。

• Barringer，K。，et al。（1990）Gene 89,117-122。

• Richardson，CC（1965）Proc Natl Acad Sci USA 54,158-165。

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