化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
ELISA檢測試劑盒新手入門的使用技術(shù)報告
閱讀：1158 發(fā)布時間：2019-3-22應(yīng)客戶們對年前產(chǎn)品預(yù)購的要求，今日開始逐漸安排發(fā)貨，具體內(nèi)容公司業(yè)務(wù)員會及時聯(lián)系。新年的開始中，公司技術(shù)專員為ELISA檢測試劑盒新手入門的使用技術(shù)報告做出一番整理，在這里分享給您，供參考。
◎ELISA方法原理
1.雙抗體(原)夾心法：檢測抗原(體)的常見方法，應(yīng)用針對抗原兩個不同決定族的兩種單抗分別作為固相載體和酶標(biāo)抗體檢測溶液中的抗原(適用于二價以上抗原，不能測 小分子半抗原)。
2.間接法：檢測抗體的方法，利用酶標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)檢測已與固相抗原結(jié)合的抗體。
3.競爭法：檢測抗原或小分子半抗原、抗體，以測抗原為例，使待測抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，結(jié)果如待測抗原含量越多，與固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原就越少，顯色越淺，二者呈負(fù)相關(guān)。
◎操作注意
① 使用干凈的塑料容器配置洗滌液，使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
② 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
③ 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
◎elisa試劑盒質(zhì)控分析
1.人員培訓(xùn)內(nèi)容包括：①檢驗項目的基本原理(ELISA試劑盒原理)；②熟悉檢測技巧，了解易出差錯的環(huán)節(jié)及難點；熟悉檢測試劑性能(包括試劑盒組成，包被片段及其組成)；③熟悉檢測儀器的原理及性能;掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識；④某些特殊項目的檢測如抗HIV等需經(jīng)有關(guān)部門組織的專門培訓(xùn)班，考試合格后持證上崗。
2.基本了解
① 1971年Engvall等人把免疫組化的EIA技術(shù)應(yīng)用于臨床檢驗發(fā)展為ELISA試劑盒技術(shù)。
② 特點：ELISA試劑盒在固相表面組裝免疫活性物質(zhì)形成"免疫吸附劑"。
③ 酶標(biāo)記免疫活性物質(zhì)，進(jìn)行信號放大；
④ 有二步溫育反應(yīng)二次洗滌過程；
⑤ 靈敏度特異性相對較高。
⑥ 局限性：只能檢測到ng水平
⑦ 精密度差(批內(nèi)CV15-20%)；
⑧ ELISA檢測試劑盒線性范圍窄(一個數(shù)量級)；
⑨ 存在"HD-HOOK"效應(yīng)。
ELISA試劑盒試驗原理：
ELISA試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)。已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關(guān)系。
ELISA試劑盒操作注意事項：
試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀釋過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法：
血清
操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g 離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
血漿
EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
細(xì)胞上清液
1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
組織勻漿
將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。
保存
如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍