徠卡顯微鏡觀察斑馬魚(yú)活體細(xì)胞
在特殊照明、電腦程序和樣品制備的幫助下，徠卡顯微鏡觀察細(xì)胞特別是活體內(nèi)細(xì)胞，能得到細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的寶貴信息。不過(guò)，這對(duì)于高等生物尤其困難。德國(guó)卡爾斯魯厄理工學(xué)院（KIT）、馬克斯·普朗克協(xié)會(huì)高分子研究所,以及美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究所（NIH）的研究人員，通過(guò)一種新觀察方法觀察到八分之一微米大小的幼魚(yú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。該研究發(fā)表在NatureMethods雜志上。
“斑馬魚(yú)的幼魚(yú)是*透明的，特別適合徠卡顯微鏡細(xì)胞遺傳學(xué)研究，”KIT的MarinaMione解釋道。為了觀察其特定結(jié)構(gòu)，研究人員通常通過(guò)用徠卡顯微鏡觀察的基因工程方法徠卡顯微鏡對(duì)幼魚(yú)進(jìn)行熒光染料染色。Mione研究了斑馬魚(yú)細(xì)胞骨架的一部分，微管。這些線(xiàn)狀微管長(zhǎng)約100µm直徑約20nm，相當(dāng)于人類(lèi)頭發(fā)的十萬(wàn)分之一。“細(xì)胞中微管無(wú)處不在，并且細(xì)胞需要通過(guò)微管進(jìn)行分裂和運(yùn)動(dòng)。”
在這項(xiàng)新的徠卡顯微鏡觀察方法中，徠卡顯微鏡樣品不是*被照明，而是特定點(diǎn)由特殊光照明。散射光被降至zui低，樣品細(xì)節(jié)非常清晰。隨后，電腦控制拍攝多種照明的一系列照片，從而得到一個(gè)總體圖片。這種巧妙的照明方式甚至允許調(diào)節(jié)景深，電腦控制能對(duì)多種景深進(jìn)行拍照，然后將其結(jié)合為三維圖像。“同時(shí)，這種徠卡共聚焦顯微鏡觀察技術(shù)平面分辨率能達(dá)到145nm而軸向分辨率能達(dá)到400nm，”MarinaMione說(shuō)。該技術(shù)能在幾秒內(nèi)完成拍照，這樣細(xì)胞活動(dòng)就不會(huì)引起清晰度下降。
研究人員基于一系列的徠卡共聚焦顯微鏡所拍的圖片圖片，得到了微管運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)視頻。在該實(shí)驗(yàn)中，對(duì)斑馬魚(yú)皮下約45µm的側(cè)線(xiàn)發(fā)育情況進(jìn)行了超過(guò)60分鐘的觀察。斑馬魚(yú)通過(guò)側(cè)線(xiàn)感知水流刺激。這種生活器官的圖像也為研究脊椎動(dòng)物細(xì)胞水平發(fā)育提供了寶貴信息。生活在淡水中的熱帶斑馬魚(yú)，作為一種遺傳學(xué)模型生物有許多優(yōu)勢(shì)。其大小易于培養(yǎng)，同時(shí)也足夠研究人員分辨單獨(dú)的器官。在徠卡顯微鏡的觀察下，斑馬魚(yú)的繁殖周期短，能產(chǎn)生大量后代。做為一種脊椎動(dòng)物，它也具有一些和人類(lèi)相同的生物學(xué)特性。
研究人員使用結(jié)構(gòu)照明
徠卡共聚焦顯微鏡技術(shù)（SIM），得到了活體多細(xì)胞生物的超分辨率3D圖像。DMD產(chǎn)生的多交點(diǎn)照明模式使研究者能排除焦外光干擾，從而使3D成像的樣品厚度比普通SIM成像厚八倍。研究人員用徠卡每秒拍攝一次2D圖像，分辨率低至水平145nm軸向400nm。研究人員在活體轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎超過(guò)45μm深處，得到了GFP標(biāo)記的微管圖像。拍攝到了斑馬魚(yú)側(cè)線(xiàn)的動(dòng)力學(xué)變化，并觀察到了包裹在膠原內(nèi)的細(xì)胞中myosinIIA與F-actin相互作用。
